扇贝多肽对H2O2损伤HaCaT细胞的保护作用

党转宁等

摘要 [目的]建立H2O2诱导HaCaT细胞氧化应激损伤的体外模型，探讨扇贝多肽（PCF）对H2O2损伤HaCaT细胞的保护作用及其作用机制。

[方法]采用不同浓度的H2O2（50、100、200、300、500 μmol/L）作用HaCaT细胞12 h后，采用CCK-8法检测细胞存活率；用不同浓度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF分别处理细胞12 h后，加入H2O2（300 μmol/L）继续作用12 h，采用CCK-8法检测细胞活力，采用酶生化法法测定细胞上清液中LDH活性以及细胞质中GSH-Px、T-AOC和CAT水平。[结果]与正常组相比，50～500 μmol/L浓度的H2O2依赖性地引起HaCaT细胞氧化损伤，300 μmol/L 的H2O2使存活率降低到56%（P<0.01）；与模型组相比，不同浓度的PCF均可保护H2O2诱导的氧化损伤，增加细胞存活率，降低细胞LDH的释放量，提高GSH-Px、T-AOC和CAT含量，增强细胞抗氧化作用。[结论]扇贝多肽能对抗H2O2诱导的氧化应激，对细胞受损具有保护作用，其机制可能与提高抗氧化酶活力有关。

关键词 扇贝多肽；H2O2；HaCaT细胞；氧化应激

中图分类号 S965.3+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）20-06618-03

Protective Effect of PCF on H2O2induced HaCaT Cell Injury

DANG Zhuanning， HAN Yantao et al

（Medical College of Qingdao University， Qingdao， Shandong 266071）

Abstract [Objective] To establish in vitro model of H2O2induced oxidative stress damage of HaCaT cells， and investigate the polypeptide from Chlamys farreris protective effect and its possible mechanism on H2O2induced damage to HaCaT cells. [Method] Cell Counting Kit8（CCK8） was used to test the cell survival rate of different concentrations （50， 100， 200， 300， 500 μmol/L） H2O2 for 12 h on HaCaT cells； different concentrations （1.42， 2.84， 5.68 mmol/L） PCF treated cell for 12 h， and then the appropriate H2O2 concentration （300 μmol/L） were adopted to treat， CCK8 was used to detect the cell viability. Enzyme biochemical method was applied to detect the activity of LDH in culture supernatants， GSHPx， TAOC and CAT levels in cell lysis solution. [Result] Compared with control group， at 50-500 μmol/L， H2O2 caused concentrationdependent oxidative damage in the HaCaT cell， at 300 μmol/L H2O2 decreased the cell survival rate to 56% （P<0.01）； Compared with model group， all different concentration PCF protected HaCaT cells from oxidative damage induced by H2O2， significantly increased the cell survival rate， decreased the release of LDH and increase GSHPx， TAOC and CAT level， enhanced antioxidation effect of HaCaT cell. [Conclusion] PCF has the significant protective effects on HaCaT cells injured by H2O2， which may be associated with the increased of antioxidase activity.

Key words Polypeptide from Chlamys farreri； H2O2； HaCaT cell； Oxidative stress

人皮膚长期暴露在外界理化环境中会受到各种损害，角质形成细胞（HaCaT细胞）是构成人最外层皮肤的主要细胞，为机体和外界提供了一个天然的屏障。机体在短期的氧化环境中暴露，能产生活性氧（ROS），可以依靠自身的抗氧化机制清除，维持氧化与抗氧的平衡状态。研究发现，经过长期的紫外线（UV）照射，机体会产生过量的ROS，氧化和损伤细胞内脂质、蛋白和DNA，并对皮肤产生有害影响，包括致癌、炎症、日光性红斑和早衰[1-2]。例如，Park等发现过量的UVB照射小鼠背部皮肤后引发小鼠表型的改变[3]。ROS通常包括1O2、O2-·、·OH和H2O2等，有研究表明，在HaCaT细胞内1O2可以氧化损伤细胞结构，改变线粒体电位和溶酶体稳定性[4-5]。笔者通过使用H2O2这种重要的活性氧为诱导剂，建立H2O2对HaCaT细胞氧化损伤的模型，旨在为抗氧化药物对UV造成的氧化应激损伤提供新的可能的治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

人角質形成细胞（HaCaT细胞 ，北京协和医院）；H2O2（Sigma公司）；RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone）；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒（购自日本Dojindo公司）；BCA蛋白定量试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测试盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）测试盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养。

HaCaT细胞培养于含10%的胎牛血清、1%青链霉素的RPMI-1640培养基中，置于含5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，每24 h换液1次，待细胞长到80%～90%时，吸取瓶中培养液，用PBS冲洗2遍，用浓度0.25%的胰酶和0.02%EDTA消化细胞，于1 000 r/min离心5 min后弃上清，加入适量培养液吹打成细胞悬液，1∶2传代。

1.2.2

H2O2损伤模型的建立。

取对数生长期的细胞每孔5 000个接种于96孔培养板，每孔加入100 μl细胞悬液，分别设置空白组、正常对照组、不同浓度H2O2 （50、100、200、300、500 μmol/L）组，每组设6个复孔，待细胞长至80%时，用H2O2处理12 h。然后，每孔加入10 μl CCK-8，培养箱中孵育3 h，使用酶标仪读取波长450 nm处OD值。按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（OD试验组-OD空白对照组）/（OD对照组-OD空白对照组）×100%。

1.2.3

药物对细胞存活率的影响。取对数生长期的细胞每孔5000个接种于96孔板中，待细胞生长至70%～80%时， 随机分为6组：空白组、正常对照组、模型组和药物组。正常组正常培养，药物组先分别加入含终浓度为1.42、2.84和5.68 mmol/L PCF的培养液，37 ℃培养12 h后，弃掉，再向模型组和药物组内分别加入含终浓度为300 μmol/L H2O2的培养液，继续培养12 h后，每组加入10 μl CCK-8，培养箱中孵育3 h，使用酶标仪检测细胞存活率。

1.2.4

细胞上清液中LDH活力的检测。取对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别设立正常对照组、模型组和不同浓度的药物组，按照“1.2.3”中方法处理后，收集各组细胞上清液，按照试剂盒说明书操作检测LDH活力。每组设3次重复。

1.2.5

细胞中GSHPx、TAOC和CAT水平的检测。取对数生长期的细胞接种于6孔板中，分别设正常对照组、模型组和不同浓度的药物组，按“1.2.3”方法处理后，收集各组细胞，按照试剂盒说明书操作检测GSH-Px、T-AOC和CAT水平。每组设3个重复。

1.2.6

数据统计与分析。使用SPSS17.0统计软件对试验数据进行统计与分析，结果以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析或t检验，各组之间多重比较采用 LSD法。

2 结果与分析

2.1 不同浓度H2O2对HaCaT细胞存活率的影响

从图1可以看出，不同浓度（50、100、200、300、500 μmol/L）的H2O2对HaCaT细胞的存活有一定的影响。与正常组相比，细胞存活率情况与H2O2呈现浓度依赖性，表现出氧化损伤趋势。当H2O2浓度为300 μmol/L时，细胞的存活率为正常组的

注：*表示与对照差异显著（P<0.05）；**表示与对照差异极显著（P<0.01）。

图1 不同浓度的H2O2对HaCaT细胞存活率的影响

56%，差异极显著（P<0.01）。因此，选择300 μmol/L的H2O2作用12 h，建立氧化损伤模型。

2.2 不同浓度PCF对H2O2诱导的 HaCaT细胞存活率的影响

从图2可以看出，不同浓度（1.42、2.84、5.68 mmol/L）的PCF对受损的HaCaT细胞存活率表现出一定的保护作用，且随着PCF浓度的升高，细胞存活率也呈梯度上升。与模型组相比，1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF将HaCaT细胞存活率由模型组的55.30%分别提高到60.70%、73.07% 和87.52%，差异显著（P<0.05）。

注：**表示与对照差组异极显著（P<0.01）；△表示与模型组差异显著（P<0.05）；△△表示与模型组差异极显著（P<0.01）。

图2 不同浓度PCF对H2O2诱导的 HaCaT细胞存活率的影响

2.3 不同浓度PCF对H2O2诱导的 HaCaT细胞LDH释放量的影响

由表1可知，与对照组比较，模型组LDH水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，不同浓度的PCF均可降低LDH释放量，5.68 mmol/L的PCF可将LDH释放量降低到37.9%，存在显著差异（P<0.01）。

2.4 不同浓度PCF对H2O2诱导的 HaCaT细胞GSH-Px、T-AOC、CAT和LDH水平的影响

3 讨论

笔者通过不同浓度的H2O2对HaCaT细胞进行氧化损伤，采用CCK-8法检测细胞存活率，因为CCK-8内水溶性四唑盐WST-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成橙黄色甲臜染料可溶解在培养液中，生成的甲臜量与活细胞数成正比，所以可根据染料颜色程度反映细胞的存活状态。研究发现，当H2O2浓度为300 μmol/L时，细胞存活率达到56%，则选择H2O2浓度为300 μmol/L，作用12 h为氧化损伤模型。PCF是从栉孔扇贝中提取，含有8个氨基酸的水溶性小分子多肽[6-7]。该研究表明 1.42、2.84和5.68 mmol/L的PCF分别将细胞存活率提高到60.70%、73.07%和87.52%，说明PCF对H2O2诱导的HaCaT细胞氧化应激有一定的保护作用。

LDH是存在于细胞内的一种糖酵解酶，可以间接反映细胞氧化應激受损的程度。当细胞膜受到氧化攻击可使膜通透性变大或破坏时，LDH可透过细胞膜渗出[8]。笔者通过收集细胞上清液，通过检测LDH活力发现，模型组LDH水平明显高于正常组，表明HaCaT细胞在受到H2O2的攻击后，细胞膜受损，通透性增大，上清中LDH释放增多，细胞活性下降。加入不同浓度的PCF后，LDH释放减少，表明PCF可对抗H2O2对HaCaT细胞的氧化损伤，保护细胞膜的完整性。

H2O2是一种强氧化剂，尤其可以氧化生物膜脂[9]，其作为活性氧家族的重要一员，对细胞的氧化应激作用已多有报道。GSH-Px、CAT和T-AOC是细胞内重要的抗氧化防御系统，对细胞的氧化具有保护作用。CAT对H2O2具有特异性，可将H2O2分解为水和氧，不需要辅助因子即可对进行H2O2清除，并且随着H2O2浓度的增大，其酶活性也将增大[10]。该研究发现，300 μmol/L的H2O2可使细胞氧化受损后，胞内CAT水平降低，而加入PCF后各组细胞内PCF水平明显升高，且与PCF具有浓度依赖性。这表明PCF可提高胞内CAT活性，增强细胞抗氧化能力，对细胞氧化应激有一定的保护作用。GSH-Px是机体内重要的氧化防御指标之一[11]，可特异地催化还原型GSH对H2O2的还原反应，降低H2O2水平，是一种胞内重要的分解H2O2的酶；T-AOC可以反映机体的总抗氧化能力。该研究结果表明，与模型组相比，药物组加入PCF后，胞内GSH-Px和T-AOC水平升高，说明PCF有提高酶活力的作用。

综上所述，H2O2能够成功诱导HaCaT细胞氧化损伤，而PCF可以降低细胞上清中LDH含量，增强GSH-Px、T-AOC、和CAT活性，抵抗细胞脂质和蛋白过氧化，保护细胞完整性。该研究为PCF的抗氧化效应提供了理论依据，其机制可能与提高抗氧化酶活力有关。

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