黄政实
摘 要:人类体质及运动能力与其他性状一样,属于多基因调控。从决定人体有氧运动能力的生理学基础上看,血液中红细胞、血红蛋白的携氧、运氧能力起着非常重要的作用。而人体中红细胞的产生是受基因调控的,主要受促红细胞生成素(EPO)基因和促红细胞生成素受体(EPOR)基因作用。只有促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPOR)结合,引发一系列信号传导,最终启动相关基因转录,生成网织红细胞和红细胞。因此,研究促红细胞生成素受体(EPOR)基因的多态性与红细胞、血红蛋白的关系,对于评定运动员的有氧能力及作为选取耐力项目运动员的指标是非常有意义的。
关键词:红细胞生成素受体;多态性;运动能力
中图分类号:G804.22 文献标识码:A 文章编号:1002–3488(2014)05–0042–04
Acceptor Gene of Haemopoietin and Kinetism
HUANG Zheng-shi
(Hainan Senior Physical Education School, Haikou 570203, China)
Abstract: Physique and kinetism of human is similar with other traits, belongs to multi gene regulation. From the physiological basis which decided physiological aerobic kinetism of human, carrying and transporting oxygen ability of red blood cell and hemoglobin in the blood plays a very important role. However, red blood cell in the human body is regulated by gene, mainly by erythropoietin (EPO) gene and erythropoietin receptor (EPOR) gene. Only the erythropoietin (EPO) and erythropoietin receptor (EPOR) combing, priming a series of signal transduction, finally promoting related gene transcription, create reticulocytes and erythrocytes. Therefore, studying on the relationship of erythropoietin receptor (EPOR) gene polymorphism and red blood cell, hemoglobin, which is very meaningful for evaluation of aerobic capacity of athletes and as a selection index for athletes.
Key words: haemopoietin receptor; polymorphism; kinetism
1 引言
人类体质及运动能力的遗传学研究已有相对较长的历史,随着科技的进步,先进研究方法的应用,使人们对人体运动能力与遗传的关系有了更深一步的了解。多年来,人类体质及运动能力的个体差异究竟在多大程度上归因于遗传,一直是体育科学界较为关注的课题之一。从20世纪20年代国外开始进行研究体质及运动能力的生物学基础及遗传因素的调节作用,现今普遍认为与人类其他生物学性状一样,体质及运动能力也同样属多基因调控。随着分子遗传学对运动医学的渗透,倘若能探明这些表型的基因标记或定位这些基因,不仅可以从根本上解决竞技体育的早期选材的问题,而且可以在分子水平探讨人类运动能力的生理机制。国内外学者经过大量的实验调查研究发现,具有不同基因多态的人群,其在某一方面的运动能力有不同的表现。目前研究与耐力能力相关的基因较多,如血管紧张素(ACE)基因、磷酸肌酸激酶(CKMM)基因、促红细胞生成素受体(EPOR)基因等。通过国外研究发现,ACE基因在第16号内含子存在一段286bp的重复序列为标记构成的I/D多态与耐力能力有明显的相关。有报道[1],澳大利亚64名划艇运动员中ACE基因中I等位基因和II等位基因型的频率显著高于普通人群。而且有研究认为,在田径项目中,运动距离越长,ACE基因插入多态的频率越高。我国对ACE基因与耐力项目的关系[2-3]也有类似报道。
促红细胞生成素(EPO)作为一种临床常用促造血因子为人们熟知,而最新的一系列研究表明,EPO 尚存在多种非造血方面的作用,包括抗凋亡作用、促血管生成作用、神经保护作用等,这可能对多系统如肾脏系统、心血管系统、神经系统等具有潜在的应用价值,目前已经发现的多种 EPO 相关受体的结构与功能及其作用通路[4]。EPOR基因的多态性与运动能力的关系,目前国内外研究报道较少。从耐力项目运动能力的生理学基础看,决定耐力项目运动能力的主要因素主要包括机体的心肺功能状况、血液的携氧、运动氧能力、肌肉组织氧的利用效率能力等。其中血液携氧、运氧能力是耐力水平高低的一个关键因素之一。血液携氧、运氧能力的高低取决于血液中红细胞数目、血红蛋白含量[5]。红细胞数目多、血红蛋白含量高,运动员的耐力水平高。因此,在运动实践中用红细胞数目、血红蛋白浓度来评定机体的有氧能力水平已被认可。
人体中红细胞的产生是受基因调控的,它主要是受促红细胞生成素(EPO)基因和促红细胞生成素受体(EPOR)基因作用。促红细胞生成素(EPO)和促红细胞生成素受体(EPOR)结合,引发一系列信号传导,最终启动相关基因转录,生成网织红细胞、红细胞。因此,研究促红细胞生成素受体(EPOR)基因的多态性与红细胞、血红蛋白的关系,对于评定运动员的有氧能力及作为选取耐力项目运动员的指标是非常有意义的。
2 红细胞生成素受体(erythropoietin receptor, EPOR)的生物学功能
2.1 EPOR及EPOR基因的结构
EPOR是红系造血细胞表面上分布的受体,它与生长激、集落刺激因子(CSF)及一些白细胞介素的受体同属一个受体家族,称为造血细胞生成素家族。1989年D`Andrea等利用鼠红白血病细胞成功地克隆了鼠EpoR[6],1991年人的EPOR cDNA也被克隆成功,由此,使人们了解了鼠和人的EPOR的结构。人的EPOR共有507个氨基酸,分子量为55.24X103,其序列与小鼠有82 %的同源性。EPOR是I型膜糖蛋白,前24个氨基酸残基形成一个信号肽,而其余的483个氨基酸残基包括223个氨基酸残基的激素结合域,24个残基的跨膜域和236个氨基酸残基的胞内域。胞外域有造血受体超家族共有的两个特征:一套4个的半胱氨酸残基和一个色氨酸-丝氨酸-X色氨酸-丝氨酸结构(Trp-Ser-X-Trp-Ser,即WSXWS,其中X代表任何一种氨基酸)的近膜结构,在WSXWS中有两个W很重要,如将两个W换成其他氨基酸,EPOR则失去EPO结合的能力,说明它起着稳定结构的作用。用X线晶体衍射方法测定出EPOR结构是一种螺旋束结构(helixbundle)。有两个亚区(sub-domains),每个亚区含有7个折叠,结构中的4个半胱氨酸与邻近的另一个受体形成二硫,以稳定EPOR结构。当EPO与EPOR结合时需要2分子的EPOR。同时具有这类特征的其他细胞因子受体包括:IL-2、3、4、5、6、7、9,GM-CSF,LIF,GH,催乳素,神经因子等。有报道[7],通过EPOR的胞外域与IL-3Rβ113胞内域组成的嵌合体的研究发现,它们都能赋予表达细胞(Ba/F3)的分化特性。这表明受体的胞外域实际上是EPOR的关键分化功能域。从受体的羧基端依次切断,再插入到Ba/F3细胞中,添加EPO来观察细胞的增殖,当插入羧基端缺少40个氨基酸的缩短型时,对低浓度EPO(1 pmol/L)也有增殖反应。这是正常情况下刺激红细胞系祖细胞增殖所需EPO浓度的1/10。这部分氨基酸的缺失,既不影响受体数目,也不影响受体亲和力,但其存在使得刺激受体产生效应的EPO浓度较不存在时高10倍,说明羧基端的40个氨基酸序列具有将信息向下调控的作用,使EPO的生物效应明显下降。当插入羧基端缺少133个氨基酸时,也有增殖反应。通过对EPOR胞内不同区域的删除发现两个功能相反的区域:近膜的大约100个含丝氨酸的区域传导增殖信号,而远离羧端区域下调这一信号,起到负调控的作用,具体位置[8]大约在羧基端40~90个残基的区域内。
对于EPOR基因的结构研究人们也进行了大量的工作,通过把EPOR基因克隆与cDNA克隆相结合,第一次较全面的使人们认识了EPOR的整个基因结构,并为以后的表达调控研究奠定了基础。基因组的克隆一般采用人胎盘EMBL3文库,用hEPORcDNA作探针,而后将克隆再亚克隆至puc18载体,从而进行测序,其外显子与内含子的边界则由OCIM1mRNA的PCR克隆所得的cDNA序列相比较而确定[9]。EPORcDNA和基因结构表明,hEPOR的基因位于19 p13.3-13.2,接近着丝点(图1),编码区6.5 kb有8个外显子和7个内含子,内含子序列从0.08 kb到2.1 kb,并包含与Alu高度同源的重复序列。外显子包括5非翻译端、信号肽区域及胞外的氨基端域。外显子6编码单一的跨膜区,胞内区由外显子7、8编码。
此基因3端不包括poly(A)加尾信号(AATAAA),另hEPOR序列中包括可能的调控序列转录因子(SP1)结合域(CCGCCC)、造血细胞系特异转录因子GATA-1结合域(TTATCT)。hEPOR基因序列从-0.8~-104 kb包括一个回文序列,但不包括CAP位点上游的TATA或CAAT序列,这两个位点通常为转录因子和RNA聚合酶结合位点,来支持转录的基础水平。Noguchi等及 Penny和 Forget[10-11]对EPOR基因结构的研究均类似报道。
2.2 EPOR的生物学功能
从晚期红系祖细胞(CFU-E)发育成为成熟的红细胞,EPO起着决定性的作用。体外人干细胞培养实验中已证实,在早期红系祖细胞(BFU-E)阶级,开始有EPOR的合成,但是量少,反应弱,到晚期红系祖细胞(CFU-E)阶段是它的高峰期。在每个细胞表面大约有300~1 000个EPO结合点,其中20 %是高亲合的(Kd=100 pmol/L),80 %呈低亲合的(Kd=600 pmol/L)。相反在网织红细胞表面没有两种类型受体结合点,只有一种类型(Kd=100~200 pmol/L)。高亲合力的受体与EPO作用,低亲合力的受体只与EPO结合,仅占位置不发生作用。由此,EPO是哺乳动物红细胞生成的主要激素调控子,对于红细胞前体细胞的生存、分化、成熟具有重要的作用。它的这种作用是通过和红系造血细胞表面分布的EPOR结合发挥作用的。当EPO和EPOR结合后,EPOR在其胞外部分一个24个氨基酸残基组成的片段的诱导下发生同种二聚反应,使与受体相连的Janus蛋白激酶(JAK2)发生转磷酸化而被激活,使信号转导剂和转录活化剂(signal transducers and activators of transcription, STAT)的酪氨酸残基磷酸化,从而导致受体和细胞内的基质的酪氨酸磷酸化,活化的STAT与基因表达调节蛋白(48 KDa和43 KDa)结合共同调节基因表达,将信息传递到下流以至细胞核促进红细胞系统的增殖和分化。JAK激酶家族是一组非受体型酪氨酸激酶,分子量约为130 KDa,包括JAK1、JAK2、JAK3、TYK2。其中,发现JAK2是信号传导中具有重要作用的酪氨酸激酶,JAK2的活化是受体产生信号所必须的,它在受体受到刺激前就与受体结合,当EPO与EPOR结合时,JAK2自身发磷酸化而被活化,活化的JAK2首先将EPOR的酪氨酸残基磷酸化,继而具有SH2区域的若干信号传导蛋白聚集到磷酸化的酪氨酸残基上,直接地或间接地被JAK2酪氨酸磷酸化而被活化。STAT(Signal transducer and activator of transcription)家族是由STAT1-6组成,其基本构造为SH2、SH3区域和羧基末端具有酪氨酸残基,通过SH2区域形成二聚体向核移行,产生与特定部位DNA结合的能力,识别特异的碱基序列,而制约着转录。STAT5为92 KDa的蛋白质,从STAT5优势抑制型变异体抑制细胞增殖来看,STAT5在细胞增殖方面起着重要作用。
现还有报道,EPOR的信号传导机制还有以下几条:(1)EPOR-JAK2-PI3K(磷酸酰肌醇-3-激酶);(2)EPOR-JAK2-ERKs(胞外信号调节激酶-1,2);(3)EPOR-JAK2-KappaB(核因子KappaB)途径;(4)EPOR-JAK2-Ras蛋白-MAPK(有丝分裂原活化蛋白激酶)途径等。可见,EPO胞内信号传导不是单一的级联通路,而是多个通路[12]交联、互补,形成网络的复杂传导过程。
3 促红细胞生成素受体(EPOR)基因的多态性与运动能力的相关性
EPO作用于骨髓造血细胞,促进红系祖细胞增生、分化,最终形成成熟的红细胞,增加体内的血红蛋白含量,提高血液对氧气的携带、运输能力,改善机体的有氧运动能力的生理学基础。EPO的这一生理作用,只有通过与红系造血细胞表面的EPOR结合,才能将细胞外的信号传导到细胞内,引发造血细胞增生、分化形成红细胞。EPOR对EPO的亲和性的高低是EPO产生作用的主要因素之一,EPOR结构是由EPOR基因来调控的。因此,EPOR基因的结构对于转录、表达、产生对EPO有高度敏感的EPOR是起着决定作用。
关于EPOR基因的多态性与运动能力的研究国内外鲜有报道。1991年Juvonen等报道了一个家庭的EPOR基因在常染色体控制区的变化[13],由于这个变化,此家族的EPOR对EPO的敏感性增加,造成血液中红细胞增多。但这种红细胞增多对机体的健康和寿命没有病理上的影响,具有这种基因型的家族成员在奥运会和世界锦标赛上的耐力项目中取得了数枚金牌。1993年De la Chapelle等对同一家庭进行研究[14],发现在EPOR基因5`端的这种简单重复性多态与疾病有一定的关联。EPOR基因的这一突变位置在6002核苷酸上由碱基G变为了碱基A,这一突变属于无意义突变,它生成了一个终止密码子TAG,结果蛋白产物的下游70个氨基酸被截去造成截断产物的出现,使继承性良性红细胞增多症产生。
关于EPOR基因上的一些突变引起EPOR蛋白的功能的报道国内外还有一些。1995年Sokol等研究[15],在原发家族性或先天红细胞增多症(PFCP)的人群中,他们的EPOR基因的核酸序列5975处一个核苷酸G,可导致自编码子430开始的移码突变,使蛋白编码提前终止,造成64个氨基酸缺失。为了进一步验证,将这种移码突变的EPOR5974 插入的碱基G转染到Ba/F3细胞中,从而使其对EPO高度敏感。Kralovics等研究(1997)发现[16],在捷克共和国的高加索人家庭中的EPOR基因在5967碱基后插入一核苷酸T,导致此类家族成员红细胞增多。Arcasoy等(1997)研究显示[17],在有些家族中EPOR基因的第八外显子上从碱基5 985-5 991有一段7bp的缺失,导致EPOR在C端有59个氨基酸截去。这一家族的个体中,有的人具有红细胞增多,但此家族中没有高血压症和心血管疾病发生。EPOR的基因突变也有可能造成它的敏感性减低,一些具有贫血症或红细胞生成障碍的病人,也有可能在EPOR基因存在着某些突变。
从EPOR基因的一些突变研究中,发现在EPOR基因中由于一些碱基的变异,影响到EPOR对EPO的敏感性的增加,使体内的红细胞生成增多。由此,使体内携氧、运氧能力的提高,改善机体的有氧运动能力。提示,是否可从EPOR基因的变异中找出某些具有较高频率的突变即EPOR的一些多态位点,来为耐力项目运动员选材提供依据。
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