真空包装冷藏鲟鱼中优势腐败菌的分离、鉴定及生长预测

焦维桢

摘 要：为监测真空包装鲟鱼在冷藏过程中的优势腐败菌动态变化，通过感官评价和传统选择性培养的方法，对真空包装冷藏鲟鱼中的优势腐败菌进行了分析；同时选择性分离筛选出代表性菌株Q-1和C-1，并基于16S rRNA基因进行了鉴定。结果表明：气单胞菌和肠科菌是真空包装鲟鱼在冷藏过程中的优势腐败菌；菌株Q-1可能为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）新亚种，菌株C-1为路德维希肠杆菌（Enterobacter ludwigii）；同时与菌株C-1相比，菌株Q-1的生长延滞期较长，但生长较快，修正的Gompertz模型能够可靠地分别预测菌株C-1和菌株Q-1在真空包装鲟鱼在冷藏过程中生长动态。

关键词：鲟鱼；优势腐败菌；分离；鉴定；生长预测

Abstract： The objective of this study was to isolate and identify dominant spoilage bacteria in cold-stored sturgeon under vacuum condition， as well as make predictions of the bacteria growth. Sensory evaluation and selective culture were used to monitor the kinetic growth of dominant spoilage bacteria. Based on 16S rRNA gene sequencing， Q-1 and C-1 were identified and isolated selectively as dominant spoilage bacteria. The results showed that Aeromonas sp. and Enterobacter sp. were dominant spoilage bacteria in cold-stored sturgeon under vacuum condition. Q-1 was likely to be a new subspecies of Aeromonas veronii， and C-1 was Enterobacter ludwigii. Compared with C-1， the lag phase of Q-1 was longer and the growth rate was higher. A modified Gompertz equation could make a credible prediction of the dynamic growth of C-1 and Q-1 in the cold-stored sturgeon under vacuum condition.

Key words： sturgeon； dominant spoilage bacteria； isolation； identification； growth prediction

中图分类号：TS254.4 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）06-0018-04

鲟鱼是世界上一种最古老的亚冷水性淡水鱼类，有“水中熊猫”之称[1]。我国鲟鱼商业化养殖起步于20世纪90年代初，随着鲟鱼人工繁育和养殖技术的不断发展与推广，目前已是鲟鱼养殖的世界第一大国[2-3]。成熟的鲟鱼一般个体较大，因此除用于生产鱼子酱、软骨等产品外，鲟鱼鱼肉也加工成小包装形式的产品，并直接进入超市货架。

新鲜鱼肉营养丰富，容易腐败，其中微生物是影响鱼肉腐败的最重要因素之一[4]。不同包装方式对鱼体微生物分布具有重要影响。大量研究表明，在有氧包装中，假单胞菌（Pseudomonas sp.）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）

和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）是鱼肉贮藏中的优势腐败菌；而乳酸菌、气单胞菌（Aeromonas sp.）、热杀索丝菌（Brochothrix thermosphacta）等则在真空包装条件下占据生长优势，Photobacterium phosphoreum则常见于气调包装中[5-9]。因此，为预防鱼肉腐败，延长产品货架期，有必要对特定贮藏条件下的优势腐败菌进行分析并进行生长预测。目前，预测微生物模型已广泛应用于各类食品的安全风险评估，例如修正的Gompertz模型、Baranyi模型及Logistic模型等都是都是应用较广泛的微生物生长预测模型[10-11]。

目前针对真空包装鲟鱼在冷藏过程中的优势腐败菌的分析较少。本研究采用基于感官评价和传统选择性培养的方法对优势腐败菌进行分析，对分离筛选得到的优势腐败菌进行了16S rRNA基因鉴定，并利用修正的Gompertz模型对其进行了生长预测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活鲟鱼（质量1～1.5 kg，体长40～50 cm） 购自回龙观海鲜市场；

平板计数琼脂（plate count agar，PCA）、结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）、气单胞菌分离琼脂（ampicillin macconey agar base，AMAB）、乳酸菌分离（deMan rogosa sharpe，MRS）琼脂、热杀索丝菌分离（streptomycin thallous acetate actidione，STAA）琼脂、铁琼脂（iron agar，IA） 青岛海博生物技术有限公司；

细菌基因组总DNA 提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix 北京博迈德科技发展有限公司；其他常规化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DZ-402E型真空包装机 浙江温州真空包装机厂；LSB35L-I型立式压力灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；TGL-20M型医用离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；E系列生物显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；KDY-9820凯氏定氮仪 北京通润机电技术公司；

TC-512型PCR仪 英国Techne公司；BG-Power300型电

泳仪 美国Baygene公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将购买的鲜活鲟鱼敲击头部致死后，去头、尾、内脏，用无菌水清洗沥干后，无菌条件下取背部白肉分割成的鱼片，每片约30 g，无菌真空包装，4 ℃贮藏，每隔1 d取样分析。

灭菌鲟鱼鱼片的制备、接种及贮藏：参照Macé等[12]的方法并适当调整，将鲟鱼鱼片在无菌环境下依次用50 g/L Na2CO3溶液、2%（V/V）的福尔马林溶液清洗，用无菌水充分洗净后沥干。经培养计数，灭菌鱼片的细菌总数小于2 lg（CFU/g）。同时，将分离得到的优势腐败菌菌株分别活化并稀释至5 lg（CFU/mL）用于鱼片接种。灭菌鱼片分别浸于5 lg（CFU/mL）不同菌液中，15 s后捞出沥干，经测定鱼肉初始接种量为3～4 lg（CFU/g），将接菌后的鱼片进行无菌真空包装，4 ℃贮藏，每隔1 d取样分析。

1.3.2 感官评价

感官评价采用质量指数法（quality index method，QIM）[13]。随机抽取不同贮藏期的鱼肉样品，对鱼肉的颜色、光泽度、通透性、气味、表面黏度和质地进行评价。QIM中每个参数的分值范围根据贮藏期的变化特征在0～3之间，其中0代表最佳的品质，分数越高品质越差。用每个参数分值之和，QI值来代表鱼肉感官品质。

1.3.3 菌落计数

参照GB/T 4789—2010《食品卫生微生物学检验：菌落总数测定》方法对样品进行微生物分析[14]。微生物培养条件如下：采用PCA培养基，30 ℃培养3 d，计菌落总数；肠科菌菌数采用VRBGA培养基，36 ℃培养2 d计数；AMAB培养基用于气单胞菌计数，并于30 ℃ 培养2 d；采用MRS培养基，36 ℃培养2 d，计乳酸菌数；热杀索丝菌菌数采用STAA培养基，25 ℃培养2 d计数。

1.3.4 优势腐败菌的分离、鉴定

对腐败鱼肉中的优势菌进行选择性培养，在可计数的最高稀释度平板，随机挑取形态不同的典型菌落，反复在相应的选择性培养基上划线，革兰氏染色、镜检，直至得到纯菌落。并对分离的菌株进行分子生物学鉴定。

16S rRNA基因鉴定：采用16S rRNA基因通用引物，27f：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1495r：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模板0.5 μL，ddH2O 11 μL。PCR反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性1 min、42 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃后延伸10 min。对所得PCR产物送至北京博迈德科技发展公司测序，将结果与NCBI中收录的其他菌株序列进行比对分析，并运用MEGA5.1软件，采用Neighor-joining法构建系统发育树。

1.3.5 优势腐败菌生长预测模型的建立

3 结 论

真空包装鲟鱼于4 ℃贮藏过程中的货架期6d，优势腐败菌为气单胞菌和肠科菌。对优势腐败菌进行传统选择性分离，并对将两株代表性菌株分别鉴定为气单胞菌Q-1和路德维希肠杆菌C-1。同时，修正的Gompertz模型能够可靠地预测气单胞菌Q-1和路德维希肠杆菌C-1在鲟鱼鱼肉中生长动态。

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