贵州侗族酸肉中一株抗氧化弯曲乳杆菌LAB26的鉴定及特性

湛剑龙

摘 要：从贵州侗族酸肉中筛选出一株乳酸菌，其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原能力、抗脂质过氧化能力分别为（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%，并且菌株有良好耐受NaCl和NaNO2的性能。

关键词：乳酸菌；抗氧化；特性

Abstract： A strain of lactic acid bacteria was selected from sour meat of the Dong ethnic minority in Guizhou， China. Its DPPH and hydroxyl radical scavenging activities， reducing power and anti-lipid peroxidation activity were （59.67 ± 6.68）%， （153.17 ± 5.50）%， （47.31 ± 4.62）% and （55.00 ± 5.19）%， respectively. Moreover， the strain had good tolerance to NaCl and NaNO2.

Key words： lactic acid bacteria； antioxidant activity； characteristics

中图分类号：TS252.54 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）06-0001-04

乳酸菌的主要功能有降低胆固醇、抗氧化、抗高血压、抗肿瘤等[1-4]。其中抗氧化能力为一般保健品所具有的功能，能清除人体自由基、防止DNA损害、延缓衰老[5]。筛选抗氧化乳酸菌具有重要意义。抗氧化乳酸菌的菌种特性已经有类似的研究[6-7]，深度发掘了乳酸菌的功能特性，对乳酸菌的生产应用打下基础。但还是有一些局限性，如不同地区，地域的乳酸菌的性能是否一致，乳酸菌在抗氧化方面的能力是否都很强，主要由什么指标体现。乳酸菌类型繁多，资源丰富，制作食物或发酵产品的材料和方法随地区不同（各种地域环境中的自然菌群不同），当地风俗习惯的不同而有很大差异，得到的乳酸菌也不同，结果也不一定相同[8-12]。本实验以一种贵州侗族酸肉为材料，筛选出一株乳酸菌，以DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原能力、抗脂质过氧化能力为抗氧化能力筛选指标，以期为抗氧化的乳酸菌的筛选提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸肉6号样品（SR6）采自江县饼妹镇銮里村，采样时严格按照GB/T 4789.1—2010《食品安全国家标准：食品微生物学检验总则》操作。

MRS肉汤培养基﹑PY培养基、PYG培养基（PY培养基中添加10g/L葡萄糖） 北京陆桥技术有限责任公司；结晶紫 天津市致远化学试剂有限公司；草酸铵 天津市北方天医化学试剂厂；碘片 天津博迪化工股份有限公司；碘化钾 天津市化学试剂供销公司；无水

乙醇 天津市富宇精细化工有限公司；过氧化氢 重庆

江川化工有限公司；甲基红﹑1，10-菲咯啉 天津市科密欧化学试剂有限公司；α-萘酚 国药集团试剂有限公司；氢氧化钾 东莞市东旺化玻仪器有限公司；细菌微量生化鉴定管（葡萄糖）﹑细菌微量生化鉴定管（麦芽糖）﹑细菌微量生化鉴定管（乳糖） 青岛高科园海博生物技术有限公司；葡萄糖﹑氯化钠﹑亚硝酸钠﹑铁氰化钾﹑三氯化铁﹑磷酸氢二钠 成都金山化学试剂有限公司；乳糖 天津市大茂化学试剂厂；二苯代苦味肼基自由基 日本进口原装 TCI；硫酸亚铁 天津市永大化学试剂有限公司；三氯乙酸﹑硫代巴比妥酸 国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾 上海广诺化学科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CX21SF1奥林巴斯生物显微镜 奥林巴斯（中国）有限公司；S1000TM Thermal Cycler PCR仪、Gel DocXR凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Gilson P型移液器 法国吉尔森公司；Micro 17R微量高速冷冻离心机 美国Thermo Electron公司；

XW-80A涡旋混合器 江苏海门市麒麟医用仪器厂；T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化与保存

采用平板稀释涂布法进行菌落分离。取3 g样品，接入MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养48 h。稀释8个梯度（10-1～10-8）后涂布灭菌的MRS固体培养基上，于37 ℃恒温培养48 h，再采用平板划线法依次接种于MRS固体培养基上37 ℃恒温培养48 h。挑出平板上生长较好的单菌落进行革兰氏染色，进行镜检，观察并记录该菌株的形态大小和颜色。直到最终的镜检结果和上次的结果一致，并且没有杂菌，可停止对该菌种的分离纯化。将纯化后的菌株―18 ℃保存于30%MRS液体培养基中备用。

1.3.2 生理生化实验

1.3.2.1 甲基红实验

接种SR6于5 mL PYG培养基中恒温培养48 h后加入甲基红指示剂，如指示剂变红，则为阳性，出现黄色则为阴性。

1.3.2.2 乙酰甲基甲醇实验（V-P实验）

接种SR6菌株于装有5 mL PYG培养基中于37 ℃培养48 h后在其中加入1.2 mL试剂A（a-萘酚纯酒精溶液）和0.4 mL试剂B（40%KOH水溶液），并进行振荡，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或37 ℃恒温箱，如2 h内仍不显现红色、可判定为阴性。

1.3.2.3 淀粉水解实验

接种SR6于装有2 mL PYG液体培养基的实管中，放入36 ℃的恒温培养箱中培养1 d，再加入2～3 滴碘液前进行振荡，滴加碘液后，若出现蓝色，再进行振荡观察蓝色是否消失。通过现象观察，可以判断淀粉是否水解或完全水解。

1.3.2.4 过氧化氢酶实验（触酶实验）

直接滴加3%过氧化氢于装有备有菌种的PYG培养基中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。

1.3.2.5 葡萄糖产酸实验

使用细菌微量生化鉴定管（葡萄糖）进行测定。接种SR6菌株50 μL于安瓿瓶中，振荡均匀，于37 ℃的恒温箱中培养24 h，观察颜色变化。出现黄色则为阳性。

1.3.2.6 麦芽糖﹑乳糖发酵实验

采用细菌微量生化鉴定管进行测定，实验方法与葡萄糖产酸实验相同。

1.3.3 DNA提取

按照细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取DNA。

1.3.4 PCR扩增细菌16S rRNA全长[13]

1）采用细菌通用引物：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5- GGTTACCTTGTTACGACTT-3；2）25 μL反应体系：1 μL模板DNA，引物（1 μmol/L）

各2.5 μL，Go Taq Green Master Mix（2×）12.5 μL，去离子水6.5 μL；3）反应程序：95 ℃预变性2 min；25个循环：94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min；最终72 ℃延伸2 min。用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

取PCR扩增产物送上海生工公司进行测序分析，在ABI DNA自动测序仪上进行测序反应。登陆NCBI网站，与已知基因序列进行比对。

1.3.5 抗氧化能力的测定

1.3.5.1 菌悬液的制备

供实菌于MRS 培养基37 ℃静置培养24 h后，发酵液3500 r/min 离心10 min，收集菌体，并用PBS洗涤3 次，最后用PBS将乳酸菌的菌数调整到109 CFU /mL，即为待测菌体（IC）[6]。

1.3.5.2 抗氧化能力的测定

菌体清除DPPH自由基的能力实验：参照文献[14]进行；菌体清除羟自由基能力实验：参照文献[14]进行；菌株还原能力实验：参照文献[6]进行；菌株抗脂质过氧化能力测定：参照文献[14]进行。

1.3.6 菌种特性研究

1.3.6.1 生长曲线的测定

接种后每2 h即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 h用分光光度计于波长600 nm测吸光度，最后根据以生长时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制生长曲线。

1.3.6.2 pH值的测定

SR6菌株直接接种于MRS培养基中，并放于恒温振荡培养箱中培养24 h，每2 h进行pH值测定。

1.3.6.3 耐盐性实验

SR6菌株分别接种于添加了0%、2%、4%和6% NaCl溶液的MRS培养基中，并放于恒温培养箱中培养24 h，于波长600 nm测吸光度。

1.3.6.4 耐硝性实验

SR6菌株分别接种于添加0、50、100 mg/kg和150 mg/kg NaNO2的MRS液体培养基。37℃ 培养24 h后，于 600 nm测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 菌株的菌落特征和菌体形态

编号：SR6；菌落特征：微透明，凸起，光滑圆整，直径（1±0.3）mm；镜检菌体形态：G+，无芽孢，链状，杆菌。

2.2 生理生化实验

3 结 论

本实验从贵州省侗族酸肉样品中筛选得到一株弯曲乳杆菌LAB26（Lactobacillus curvatus strain LAB26）。具有较强抗氧化能力：其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、还原能力、抗脂质过氧化能力分别为（59.67±6.68）%、（153.17±5.50）%、（47.31±4.62）%、（55.00±5.19）%。SR6生长周期较短，调整期0～2 h、对数期2～14 h、稳定期14～20 h、20 h以后进入衰亡期。SR6在含6%NaCl的MRS培养基中生长状况依然良好，并且对NaNO2有很好的耐受力。

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