一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法研究

代丽娟　郑唐春　臧丽娜　曲冠证

摘要[目的]设计一种简易安全的从农杆菌和酵母中提取RNA的方法。[方法]利用Triton X-100和SDS作为裂解液的主要成分，通过热激法裂解菌体，然后进行一系列的抽提、沉淀、洗涤，获得纯净的RNA；并用琼脂糖凝胶电泳及核酸检测仪检测总RNA的纯度、浓度及质量。[结果]该方法能高效裂解菌体，有效防止RNase污染，可以获得高质量的RNA。[结论]该研究成功的得到一种简易、安全提取农杆菌和酵母RNA的方法，为后续的基因表达分析奠定了技术基础。

关键词农杆菌；酵母；RNA；提取方法

中图分类号S182文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01908-02

收稿日期20140212通过基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。常用的工程菌有大肠杆菌（Escherichia coli）、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）。自从科学家发现根瘤农杆菌能够侵染植物后，农杆菌介导法促使植物转基因技术得到了快速发展[1-2]。酵母作为高等真核生物，是人类基因组研究的模式生物，在连锁分析和定位克隆方面为人类遗传性疾病研究提供了丰富的信息[3]。RNase不仅广泛存在且化学性质稳定，分离得到的RNA很容易被讲解，因此RNA的分离已经成为分子生物学的技术之一[4-7]。为了在分子水平上研究生物个体的基因功能，提取纯度高、质量好的RNA是工作基础。目前，RNA的提取已经有大量报道，主要针对动物、植物和特定的细菌等[8-9]。其中的一些方法不仅操作繁琐，试剂毒性较大，而且提取效果并不是非常的理想。笔者利用一种操作简单、试剂低毒的方法裂解并分离RNA，以期获得高质量的RNA，用于后期的PCR扩增和northern blot等试验。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。农杆菌（Agrobacterium tumefaciens EHA105）和酵母菌（Saccharomyces cerevisiae INVSC1），由实验室培养。

1.1.2 主要试剂。LB培养基（1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH 7.0），YPD培养基（1% Yeast extract，2% Peptone，2% Dextrose，pH 7.0），裂解液（2% Triton X-100，2% SDS，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）、三氯甲烷、无水乙醇、RNase-Free ddH2O、TAE、EB和琼脂糖等，均为国产分析纯，市售。

1.2方法

1.2.1 RNA的提取。①将农杆菌和酵母单克隆菌落，在无菌操作下，分别接入3 ml的LB和YPD培养基，在28 ℃、200 r/min的恒温培养箱中培养20～24 h，吸取1.0 ml的培养液，于10 000 g下离心2 min，弃上清，收集菌体；②向菌体中加入300 μl的裂解液，涡旋振荡30 s，彻底重悬菌体，将含有重悬菌体的离心管，放入液氮中冰冻2 min，然后转入95 ℃水浴锅中热激2 min，重复上述冰冻-热激2次，最后强力涡旋振荡1 min；③向离心管中加入等体积的三氯甲烷，充分涡旋振荡1 min，然后室温下在20 000 g离心5 min；④转移上清至新的离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，温柔混合样品，室温静置5 min，（可选）放置于-20 ℃下1 h以上可以增加RNA的产量；⑤室温下，在20 000 g离心10 min；⑥吸取上清，用浓度70%的乙醇清洗沉淀2次；用离心机快速离心10 s，吸净残余液体，室温晾干；⑦用30～50 μl RNase-Free ddH2O重悬沉淀。

1.2.2 RNA质量的检测。①琼脂糖凝胶电泳检测。分别取RNA 样品1.0 μl，在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，110 V恒压，20 min。紫外灯下观察RNA 的条带，并照相记录结果。②RNA 的产量和纯度检测。各取1 μl RNA样品，用NanoDrop 2000c核酸浓度测定仪分别测量OD260/280、OD260/230值以及RNA 的浓度（ng/μl）。

1.2.3 RNA的纯化与浓缩。如果提取的RNA含有微量的DNA污染或者浓度较低，可以加入适当的DNase I消化后，将获得的RNA进行纯化浓缩。

2结果与分析

2.1总RNA样品的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是总RNA完整性检验的常规方法，检测时通过设置高压快速电泳，在较短的时间内，使RNA样品中的23S、16S明显的区分开来。为了保证RNA不被电泳槽内的RNase降解，跑胶前应清洗电泳槽，更换新鲜预冷的TAE缓冲液，这样可以获得更真实的RNA情况。图1表明，所提取的农杆菌和酵母菌总RNA中23S、16S能区分为2条带，未发生拖尾等现象。而且大部分样品的5S RNA也比较清晰，说明提取的样品RNA没有发生降解，完整性较好。

注：M为DNA marker DL5000；泳带1～3为农杆菌总RNA；泳带4～6为酵母菌总RNA。

图1农杆菌和酵母菌总RNA的电泳图谱2.2总RNA样品的纯度分析 将所提取的总RNA经NanoDrop 2000c核酸浓度测定仪检测其230、260、280 nm的吸光度值并计算OD260/280、OD260/230的比值。由表1可知，280 nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的OD260/280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。该方法提取的总RNA的OD260/280的值在1.783～1.921，接近于2.0，说明样品中残余的蛋白等污染物较少。230 nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的OD260/230比值为2.5。若比值小于2.0，表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。结果显示，该方法提取的总RNA的OD260/230的比值几乎均大于2.0，说明样品中可能还参与少量的盐类或有机溶剂。