3种植物浸提液对土人参愈伤组织多糖和黄酮含量的影响

陈志宽　张杨　赖育菠　刘顺会　陆幸妍

摘要[目的]探讨胡萝卜、土豆、番茄的浸提液对土人参愈伤组织的多糖和黄酮含量影响。[方法]在土人参愈伤组织诱导培养基中分别添加胡萝卜、土豆、番茄浸提液诱导愈伤组织生成，培养25 d后，用紫外分光光度计法测定土人参愈伤组织多糖和黄酮的含量。[结果]3种浸提液都能提高土人参愈伤组织多糖含量（P<0.01）；其中以添加胡萝卜浸提液的最高，但胡萝卜浸提液对土人参愈伤组织的黄酮含量没有显著影响（P>0.05）；土豆浸提液和番茄浸提液则使土人参愈伤组织黄酮含量降低（P<0.05）。[结论]培养基中添加胡萝卜、土豆和番茄浸提液有助提高土人参愈伤组织的多糖含量，但未能提高甚至会降低其黄酮含量。

关键词土人参[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]；愈伤组织；植物浸提液；多糖；黄酮

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01910-03

基金项目广东药学院2012年省级大学生创新创业训练计划项目（1057312001）；广东药学院2012年校级大学生创新实验项目（14）。

作者简介陈志宽（1990-），男，广东廉江人，本科，专业：生物技术。*通讯作者，刘顺会，副教授，从事生态学研究。*通讯作者，陆幸妍，副教授，从事细胞生物学研究。

收稿日期20140210土人参[Talinum paniculatum （Jacq.）Gaertn]，又名人参菜，属马齿苋科1年生或多年生草本植物[1]，主要分布于安徽、河南、广西、广东、四川、贵州和云南等地。土人参含环烯醚萜、蒽醌类、多糖、黄酮类和挥发油等化合物[2]，主要用于治疗气虚乏力、肺痨咳血、眩晕和月经不调等[3]。随着土人参食疗功效研究的深入开展，作为一种集食用、药用、观赏为一体的新型保健食材，其潜在价值正日益显现。

植物多糖是单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，是一类重要的信息分子。研究发现，多糖及糖复合物参与和介导了细胞各种生命现象的调节，具有免疫调节、降血糖血脂和抗凝血等生物活性[4]。冉靓等还发现，土人参多糖对PC12细胞的生长有一定促分化作用[5]。黄酮类化合物是具有多种的生物学活性的次生代谢产物。研究表明，土人参黄酮具有清除羟自由基、超氧离子自由基的作用，其抗氧化性明显[6]。

自20世纪90年代对土人参的研究开展以来，对土人参化学成分的研究大多从检测和药理两个层面深入，而设计试验影响土人参化学成分含量的研究并不多见。试验在借鉴自然界不同植物品种之间存在相生相克特性的背景之下，探讨胡萝卜、土豆、番茄3种浸提液的添加培养对土人参愈伤组织中多糖和黄酮含量的影响，以期为进一步探究植物组织培养过程中不同植物品种材料之间相互作用的机制提供试验数据，并为土人参这一新型保健食材的开发利用提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象。土人参植株，由广东药学院生命科学与生物制药学院刘顺会副教授馈赠，取其新鲜、嫩绿叶片作为组培材料。

1.1.2主要仪器。SB5200D超声波清洗机，购自宁波新芝生物有限公司；TGL16G离心机，购自上海安亭科学仪器厂；759紫外可见分光光度计，购自上海菁华科技仪器有限公司；TE212L电子天平，购自SARTORIUS CO.GERMANY。

1.1.3主要试剂。浓硫酸，购自衡阳市凯信化有限公司；蒽酮，购自Aladdin industrial corporation；芦丁，购自Aladdin chemistry co.Ltd；无水葡萄糖、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.2方法

1.2.1材料的预处理。取新鲜外植体，消毒后切成 0.1 cm3大小接种到基础培养基上，暗培养10 d。基础培养基为：MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖。

1.2.2植物浸提液的制备。分别称取削皮后的胡萝卜、土豆和番茄各100.00 g，切碎后放入搅拌机中，统一加入50 ml单蒸水，搅拌至成匀浆状态。取出所有匀浆过8层纱布，丢弃残渣，滤液用12 000 r/min离心，取上清液备用。在无菌操作条件下，吸取上清液透过0.22 μm滤膜，将滤液收集在已高压灭菌的15 ml离心管中。

1.2.3含植物浸提液培养基的制备。对基础培养基进行高压灭菌，待其无菌培养基冷却15 min后，吸取2 ml无菌浸提液加入到23 ml基础培养基中，用枪反复吹打并摇匀，待其完全冷却凝固备用。

1.2.4愈伤组织培养。将土人参愈伤组织转移至含植物浸提液的培养基中，在光照度2 000 lx、12 h/d条件下培养25 d，每天观察愈伤组织状态。

1.2.5对照品溶液和供试样品液的制备。（1）测黄酮含量的样品制备。称取干燥愈伤组织粉末0.400 g，按照乙醇浓度80%，料液比1∶40（g/ml，W/V，下同），浸提温度60 ℃，浸提时间1 h，离心得上清液，定容至25 ml备用。（2）测多糖的样品制备。称取干燥愈伤组织粉末0.200 g，置于100 ml锥形瓶中，加沸水25 ml，加盖，超声提取10 min，冷却后抽滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并抽滤，滤液收集在50 ml容量瓶中，定容至刻度，得可溶性糖的提取液。吸取提取液2 ml，置于另一50 ml容量瓶中，以蒸馏水定容，摇匀备用。

1.2.6测定波长的选择。（1）精密量取葡萄糖标准液1.0 ml，置20 ml试管中，加入蒽酮溶液2.0 ml，参照紫外-可见分光光度法（2010版药典附录VA）测定，观察紫外吸收光谱，确定最佳测定波长。（2）精密量取芦丁标准液1.0 ml于50 ml容量瓶，加浓度5%的NaNO2 1.5 ml摇匀，放置6 min后；加浓度10%的Al（NO3）3 1.5 ml，摇匀，放置6 min；再加20 ml浓度4%的NaOH溶液，摇匀显色，用浓度80%乙醇定容，摇匀静置10 min，观察紫外吸收光谱，确定最佳测定波长。

1.2.7线性关系的考察。（1）葡萄糖线性关系的考察。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 ml葡萄糖标准液，按“1.2.6”项下蒽酮比色法显色，以蒸馏水为空白对照，于波长626 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。（2）芦丁线性关系的考察。精密吸取0.3、0.6、0.9和1.2 ml芦丁标准液，按“1.2.6”项下硝酸铝络合显色法，以浓度80%乙醇为空白对照，于波长254 nm处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，浓度C（mg /ml）为横坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.8精密测定与计算。按上述方法测定各组的多糖和黄酮吸光度值，经标准回归方程计算得出提取液中多糖或黄酮浓度，根据下列公式求出各组多糖和黄酮的百分含量。

多糖/黄酮的含量=CV总D1mV测×100%

式中：C（mg/ml）：由回归方程得出的多糖或黄酮浓度；V总（ml）为土人参多糖和黄酮提取液的总体积；V测（ml）为测定时取用样品的体积；D为稀释倍数；m（mg）为样品质量。

1.2.9统计学处理。采用SPSS 13.0进行数据处理，组间多重比较采用单向方差分析（OneWay ANOVA）。P<0.05为差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。

2结果与分析

2.1测定波长的选择葡萄糖溶液的紫外吸收光谱显示，λmax=626 nm，故选择626 nm为多糖测定波长。芦丁标准液的紫外吸收光谱显示，λmax=254 nm，故选择254 nm为黄酮测定波长。

2.2线性关系的考察计算得葡萄糖标准液的线性回归方程为：Y=0.011 3X-0.020 2，相关系数R为0.998 8。试验结果表明，在0.200～1.200 mg/ml范围内，葡萄糖浓度与吸光度呈良好的线性关系。计算得芦丁标准液的线性回归方程为：Y=248.600 0X+0.063 1，相关系数R为0.990 7。试验结果表明，在0.400～1.800 mg/ml范围内，芦丁浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.3含植物浸提液培养基对土人参多糖含量的影响图1表明，与对照组相比，胡萝卜组和土豆组的多糖含量均显著提高（P<0.01），其中胡萝卜组的多糖含量高于对照组的7.5%，增长89.1%；土豆组的高于对照组的5.6%，增长66.7%；番茄组的没有显著性差异（P>0.05）。与番茄组相比，胡萝卜组和土豆组的多糖含量亦是极显著高于番茄组（P<0.01），分别相差6.7%和4.8%；与土豆组相比，胡萝卜组无显著性差异（P>0.05）。

注：与对照组比较**P<0.01；与番茄组比较##P<0.01。

图1不同植物浸提液添加培养对土人参愈伤组织多糖含量的影响（n=3）2.4含植物浸提液培养基对黄酮含量的影响图2表明，相比对照组的黄酮含量，土豆组和番茄组的黄酮含量显著低于对照组（P<0.05），分别降低0.3%和0.5%；而胡萝卜组的黄酮含量与对照组的黄酮含量仅相差0.1%，无显著性差异（P>0.05）。与胡萝卜组比较，土豆组和番茄组的黄酮含量显著低于胡萝卜组的黄酮含量（P<0.05），分别相差0.4%和0.6%；而番茄组和土豆组的黄酮含量相比则无显著性差异（P>0.05）。