辣椒SRAP—PCR反应体系优化及杂交群体多态性引物筛选

张佳琦　吕庆芳　董黎梨　李映志　叶春海

摘要[目的]对辣椒SRAP反应体系进行研究和优化，并利用优化体系对164对多态性引物进行筛选。[方法]采用单因素随机试验设计和L25（65）正交试验设计对辣椒SRAP反应体系中6种关键因素（退火温度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA）进行体系优化，并以“泡椒”ד青皮大椒”的亲本和F1代为材料，利用聚丙烯胺酰胺凝胶进行筛选。[结果]辣椒SRAPPCR的最佳反应体系为：退火温度35.5 ℃，Taq DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 2.25 ng/μl，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.4 μmoL/L，Mg2+ 2 mmol/L，总体积为20 μl。利用该体系，从164对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、条带稳定的31对引物组合。[结论]该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒育种中的应用奠定了基础。

关键词辣椒（Capsicum spp.）；正交试验设计；单因素随机试验设计；SRAP；PCR

中图分类号S641.3文献标识码A文章编号0517-6611（2014）07-01913-04

辣椒（Capsicum spp.）是一种世界性的蔬菜作物，即可鲜食又可用作辣椒油、辣椒红素和辣椒素的提炼[1]，同时含有丰富的VC和矿质元素[2]，是我国人民饮食结构的重要组成部分。随着SSR（Simple sequence repeat，简单序列重复）、RAPD（Random Amplified polymorphism DNA，随机扩增多态性DNA）、ISSR（Inter-simple sequence repeat，简单序列重复区间扩增多态性）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性）和SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism，相关序列多态性）等DNA分子标记技术的发展，其在辣椒育种中的运用日益增多[3-10]。

SRAP标记是Li和Quiros开发的一种基于PCR （ polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）的新型分子标记技术[11]。该标记通过独特的引物设计可对开放阅读框 （open reading frames，ORFs）进行扩增，因个体间内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。由于其具有多态性丰富、成本低廉、操作简便、稳定性好和高度共显性等特点[12]，被广泛用于遗传多样性评价[13]、种质材料鉴定[14]和遗传图谱构建[15-18]等最早开展SRAPPCR反应体系的优化研究。随后，这一分子标记技术被用于辣椒的种子纯度检测[20-21]、遗传多样性分析[22-24]、辣椒杂种优势的预测[25]和自交系遗传关系评价[26]等方面。

由于SRAP分子标记直接扩增开放阅读框，提高了扩增结果与表型性状的相关性，可将分子标记与基因克隆直接结合起来[27]，因此而成为遗传图谱构建的重要分子标记之一[28-31]，但在辣椒遗传图谱构建中的应用还比较少。鉴于此，笔者构建 “泡椒”ד青皮大椒”的分离群体，通过SRAPPCR扩增体系优化，利用亲本和F1代材料筛选扩增多态性丰富且条带稳定的引物组合，以期为辣椒遗传图谱的构建奠定基础。

1材料与方法

1.1材料 以2013年3月种于广东雷州的青皮大椒、泡椒及其F1代植株为试验试材。Taq DNA聚合酶和dNTPs，均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；1 000 bp DNA Marker，购自购自宝生物工程（大连）有限公司；SRAP引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR仪，购自Biometra；凝胶电泳设备，购自北京鸿涛基业科技发展有限责任公司。

1.2基因组DNA的提取与检测 采用改良CTAB法[32]提取青皮大椒的总DNA，并采用紫外分光光度计法检测其浓度，于-20 ℃保存备用。

1.3SRAPPCR单因素随机试验 以青皮大椒总DNA为材料，以含Taq DNA聚合酶1 U、Mg2+ 2 mmol/L、模板2.5 ng/μl、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.4 μmol/L的20 μl反应体系为基础，分别改变退火温度（33、34、35、36和37 ℃）、Taq DNA聚合酶量（0.2、0.5、1.0、1.5和2.0 U）、模板浓度（0.5、1、2、2.5和5 ng/μl）、dNTPs浓度（0.05、0.10、0.20、0.25和0.50 mmol/L）、引物浓度（0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 μmol/L）和Mg2+浓度（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mmol/L），以EM6为正向引物、ME18为反向引物，进行5水平单因素随机试验，3次重复。

1.4扩增程序 参考Li和Quiros的方法：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，35 ℃，1 min，72 ℃，1 min，5个循环；随后将退火温度升至50 ℃，其他条件不变，进行35个循环；最后以72 ℃延伸10 min。扩增产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，银染检测[11]。

1.5SRAPPCR正交试验 以青皮大椒总DNA为模板，采用L25（65）正交试验设计（表1）。SRAP正向引物为EM6，反向引物为ME18，总反应体系20 μl，基本扩增程序按“1.4”中方法；重复2次。从扩增条带数、凝胶染色背景和带的强弱等方面综合评价扩增效果[33]，以条带数为主，对所有结果按照效果好坏排序，取其排序的数字作为扩增效果的评价值，评价值越高，结果越好。