聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳术后乳腺组织中NF-κBp65和TNF-α的表达及意义

苏顺清 田可敬 朱雁 戴新明 韩勇 张一鸣 宋娟

[摘要]目的：通过检测聚丙烯酰胺水凝胶（PAHG）置入人体后乳房病变组织内NF-κBp65、TNF-α表达，探讨二者与PAHG注射隆乳术后乳腺病理改变的关系。方法：采用免疫组化染色法检测20例正常乳腺组织，40例PAHG注射隆乳术后乳房病变组织中NF-κBp65、TNF-α 阳性表达细胞，比较分析两组之间的差异。结果：①HE染色结果:光镜下见切片中含大量均质无定形凝胶样注射物，PAHG周围有不同程度纤维组织增生，伴或不伴纤维组织玻璃样变性，并见炎性细胞浸润；或局部呈异物巨细胞反应，部分乳腺导管扩张；②免疫组化结果:NF-κBp65、TNF-α阳性细胞少见于正常乳腺组织中，而在实验组近注射物周围NF-KBp65、TNF-α阳性细胞数目增多，具有显著统计学意义。但是NF-KBp65、TNF-α阳性细胞率与PAHG体内存留的时间长短无明显相关性。结论：NF-κBp65与 TNF-α在PAHG注射隆乳术后病变组织中的表达存在正性相关关系。NF-κBp65、TNF-α参与了聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳者乳房病变组织的免疫反应过程，可能通过相互影响而共同诱导病变部位无菌性炎症、纤维组织增生等反应的发生。

[关键词]聚丙烯酰胺水凝胶；细胞核因子-κB；肿瘤坏死因子-α；细胞因子；注射隆乳术

[中图分类号]R655.8 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）09-0730-04

Exprssion of NF-κBp65 and TNF-α in human breast tissues injected with Polyacrylamide Hydrogel (PAHG) and clinical significance

SU Shun-qing,TIAN Ke-jing,ZHU Yan,DAI Xin-ming,HAN Yong,ZHANG Yi-ming,SONG Juan

(Department of Plastic Surgeoy,Tungwah Hospital of Dongguan Guangdong,Dongguan 523110,Guangdong,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the rate of NF-KBp65 positive cells and TNF-α positive cells in human breast tissues with Polyacrylamide Hydrogel (PAHG) Injection.By contrasting with control group we should guess the relationship between NF-KBp65,TNF-α positive with immuno-inflammation, fibroelastosis in human breast tissues with PAHG Injection.MethodsDetect the expression of NF-KBp65,TNF-α in 40 cases with PAHG Injection and 20 normal breast tissues by immuno-histochemistry sp,and analyzed all the samples combining with HE staining.Results①Masses of homogeneous amorphous polyacrylamide gel could be observed under light microscope. Around the PAHG,there were fibrous tissues proliferation with or without hyaline degeneration,and plenty of macrophages, monocytes, and histicytes but lymphocytes acuumulates surrounded.②Positive cell ofNF-κBp65 ,TNF-α were hardly found in normal breast tissues, while lots of them could be observed in human breast lesion tissues Injected with PAHG,especially obvious in fibrous connective tissue area (besides the PAHG).And the expression was not ratio with implantion time.ConclusionNF-κBp65 and TNF-α play an important part in immuo-inflammatary reactions of breast tissues with PAHG Injection.Which induce fibrous tissues proliferation and aseptic inflamation in lesion area.Meanwhile,NF-κBp65 and TNF-α has Pearson positive relevance in the changes.

Key words:Ployacrylamide Hydrogel(PAHG); NF-κB; TNF-α; cytokine;injective augmentation mammolplasty

聚丙烯酰胺水凝胶（PAHG）曾一度被视为良好的软组织填充材料，在东欧及亚洲等地区被广泛应用。随着PAHG注射患者增多及注射时限推移，PAHG注射隆乳术后并发症报道逐渐增多[1-2]。虽然我国政府早在2006年即禁止使用PAHG进行注射隆乳，但是已完成注射治疗的数十万病例术后并发症逐渐凸显出来。细胞核因子-κB（NF-κB）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）参与多种炎症及肿瘤性疾病的发生[3-4]。PAHG长期置入人体后可引发乳腺及其周围组织的免疫应答反应及炎性细胞增殖，导致发生一系列的并发症的发生[5-8]。本研究主要采用免疫组化染色的方法检测PAHG注射隆乳术后乳房病变组织中NF-κBp65及TNF-α的表达，探讨NF-κBp65、TNF-α与PAHG注射隆乳术乳腺组织病理改变的关系。

1资料和方法

1.1 一般资料：收集2006年1月至2011年1月因“双侧聚丙烯酰胺注射隆乳术后”病例46例。患者年龄24～41岁，平均31.8岁，隆乳术后时间为1～10年不等，平均5.3年。所选病例中乳房硬结或包块者40例；合并注射物移位、双乳变形或不对称者6例；PAHG注射合并硅胶假体置入隆乳者2例；PAHG注射合并哺乳期或产褥期乳腺炎者4例。经过筛选排除6例，最终病例40例。

1.2 研究对象分组

1.2.1 实验组（40例）：依据PAHG聚集部位分2组：①A组：囊壁组 （38例），包裹PAHG周围形成的纤维包膜组织，②B组：非囊壁组（34例）：囊壁外周受累乳腺或肌肉组织。依据PAHG注射隆乳时限（即PAHG体内存留时间）分3组：①Y1组(15例)：注射时限4年及以内；②Y2组(15例)：注射年限4～7年；③Y3组(10例)：注射时间7年以上。

1.2.2 对照组（20例）：收集同期于我院乳腺外科门诊及住院患者中行乳房诊断性穿刺病理结果证实“正常乳腺组织”20例作为对照。

1.3 研究方法

1.3.1 主要试剂：兔抗TNF-α多克隆抗体（抗体工作液浓度为1:100）购买自武汉博士德生物技术有限公司，鼠抗NF-κBp65单克隆抗体（抗体工作液浓度为1:300）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，SP免疫组化检测试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3.2 取材及切片制备：根据患者具体情况采用乳晕或乳房下皱襞切口，将切除的包裹PAHG囊壁组织及其周围受累乳腺或/和肌肉组织置于l0%甲醛固定液中固定，常规石蜡包埋、储存。收集所选病例（40例）蜡块标本共52例及对照组蜡块20例，每例各做4μm连续切片3张，分别用于进行HE染色及TNF-α、NF-κBp65免疫组化染色。

1.3.3 实验方法：免疫组化染色采用SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法）。

1.3.4 观察的指标及阳性细胞判断标准：TNF-α阳性细胞：免疫组化染色后细胞质呈棕黄色或褐色着色的细胞；NF-κBp65阳性细胞，经免疫组化染色后细胞质和/或细胞核呈棕黄色或褐色着色的细胞。每张切片在高倍显微镜下随机选择10个无重叠视野，计算每个视野中阳性细胞百分比，取平均值作为该标本的阳性细胞表达率。

1.3.5 统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析。对不同分组中TNF-α及NF-κBp65细胞阳性表达率之间的差异采用t检验及Kruskal-Wallis H检验（检验水准α=0.05）进行分析；TNF-α及NF-κBp65在病变组织内的表达之间的关系采用pearson相关分析。

2结果

2.1 常规HE染色结果：光学显微镜下见切片中含大量淡蓝色或淡紫红色均质无定形聚丙烯酰胺水凝胶物，围绕PAHG周围有不同程度纤维组织增生，伴或不伴纤维组织玻璃样变性，并见巨噬细胞、多核巨细胞、少许中性粒细胞浸润，但淋巴细胞少见；局部呈异物巨细胞反应并/或形成异物肉芽肿（见图1）；腺体、肌肉、脂肪组织间亦可见蓝染无定形注射物，部分乳腺导管扩张，乳腺小叶轻度或无明显增生性改变；部分病例可见胸大肌细胞发生玻璃样变性，甚至萎缩改变（见图2）。

2.2 免疫组化染色结果：实验中所得数据（阳性细胞率）均采用x±s表示，界值P<0.05，应用SPSS13.0统计分析软件，对不同组病例中的TNF-α、NF-κBp65阳性表达率差异进行t检验及Kruskal-Wallis H检验分析。对PAHG注射组病变组织中TNF-α阳性表达与NF-ΚBP65阳性表达两者之间的关系采用pearson相关分析。

2.2.1 PAHG注射隆乳术后病变组织中NF-ΚBp65的表达（见表1～2）：NF-ΚBp65在PAHG注射组（阳性细胞率54.00%±19.59%）表达于成纤维或纤维细胞、异物巨细胞胞浆中，有的乳腺腺泡上皮细胞、导管上皮细胞、肌细胞胞浆内也可见棕黄色或黄色颗粒物质，甚至一些细胞胞核也可呈阳性改变（见图3～4）。

2.2.2 PAHG注射隆乳术后病变组织中TNF-α的表达情况（见表1～2）：TNF-α阳性细胞呈黄色或棕黄色着色，在PAHG注射组均可见TNF-α阳性细胞，主要表达于异物巨细胞、巨噬细胞的胞浆，少量成纤维细胞胞浆也可见棕黄色颗粒；而在正常对照组TNF-α阳性细胞较少见（见图5～6）。

2.2.3PAHG注射隆乳术后病变组织内TNF-α表达与NF-ΚBP65表达关系：对PAHG注射组病变组织中TNF-α阳性表达与NF-ΚBP65阳性表达两者之间的关系采用pearson相关分析，r=0.294，两者之间存在正性相关关系。

3讨论

PAHG作为软组织填充材料进入体内可引起机体细胞免疫及体液免疫的改变；NF-κB 是一种重要的细胞因子上游调控因子，当细胞受到细胞外信号刺激时，NF-κB 便迅速从细胞质移位到细胞核，和基因的启动子结合，促进相关基因的转录，参与炎症反应、免疫应答、自由基损伤等病理生理过程[9]。TNF-α则是一重要的促炎症细胞因子，可诱导细胞凋亡、蛋白激酶、NF-κB等的激活，参与细胞死亡、代谢、炎症反应和纤维组织增生等生物反应[3]。

3.1 PAHG注射隆乳术后组织病理改变

3.1.1 PAHG注射隆乳术后临床观察：本组病例均有不同程度的乳房包块或硬结，可能与PAHG注射后不被人体组织吸收，或重力作用促使PAHG聚集、移动有关；加上术后注射部位规律或不规律的按摩和肌肉活动，会使得PAHG向周围组织浸润，甚至侵犯乳腺组织或胸大肌，以分散的团块形式分布于乳腺内、皮下或超出乳房以外的区域，导致乳房形态异常。注射PAHG隆乳术后，手术中取出的游离PAHG颗粒，呈淡黄色半透明颗粒状外观；于PAHG周围见菲薄的纤维组织包膜。PAHG作为异物，刺激机体产生免疫炎症反应，形成的纤维包膜组织较薄，对外部各种作用力（重力、压力等）耐受性差，这也导致PAHG易于向周围组织间隙中扩散。分散在脂肪、腺体或者胸大肌组织中，更有甚者受累肌肉或腺体组织变性，呈黄白色透明外观，失去正常组织弹性。

3.1.2 PAHG注射隆乳术后乳腺组织病理学改变：PAHG注射后早期细胞增生明显，围绕PAHG周围有大量的多核异物巨细胞、大量的增生的组织细胞与成纤维细胞。发现聚丙烯酰胺水凝胶大量分散于乳腺、脂肪及横纹肌内，伴有大量多核巨细胞及明显的异物肉芽肿，成纤维细胞增生，部分横纹肌失去正常结构甚至变性消失。本组术中乳房病变组织进行HE染色检查发现：PAHG注射术后患者病理切片光镜下见大片蓝染均质无定形聚丙烯酰胺水凝胶，周围有不同程度的纤维组织增生，越靠近注射物部位纤维增生、免疫炎症反应越重，并伴有巨噬细胞、少量的中性粒细胞等炎性细胞浸润；部分区域还可见异物巨细胞反应并形成肉芽肿或隆乳剂性假瘤改变；而且上述乳房局部免疫炎症反应随PAHG在体内存留而持续存在。

3.2PAHG注射隆乳术后乳腺组织局部免疫反应：在本组正常乳腺中也可见少量NF-κBp65表达，主要位于乳腺间质细胞或单核-巨噬细胞胞浆内，这与相关文献报道结果一致[9]。但在聚丙烯酰胺水凝胶注射隆胸术后病变组织NF-κBp65表达明显增加，且注射物周围囊性包膜组织NF-κBp65阳性细胞增加更明显，并出现纤维增生及炎性细胞、异物巨细胞的浸润。NF-κBp65阳性细胞率在PAHG在体内存留时间分组中比较无明显差异，提示聚丙烯酰胺水凝胶注入人体后作为异物长期刺激注射部位发生免疫炎症反应。在PAHG隆乳术后的乳腺组织中TNF-α阳性细胞也明显增多，同样在注射物周围囊性包膜组织内聚集明显，与非包膜组织（乳腺及肌肉组织）内阳性表达细胞率比较有显著统计学意义；但在正常乳腺中少见TNF-α阳性细胞的表达。

肿瘤坏死因子-α是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，是机体炎症与免疫的重要介质。TNF-α在体内过量产生和释放时则会破坏机体的免疫平衡 ,并与其它炎症因子一起产生多种病理损伤[10]。细胞核因子-κB 是一种重要的细胞因子上游的调控因子，核因子-κB(NF-κB)是一类主要参与炎性因子表达调控的转录因子，与某些基因启动子及增强子区的序列结合,启动或增强这些基因的转录，参与炎症反应、免疫应答、自由基损伤等多种生物学效应[4]。

本研究结果显示聚丙烯酰胺水凝胶注射组乳腺病变组织内NF-κBp65、TNF-α阳性表达细胞率明显高于对照组正常乳腺组织，聚丙烯酰胺水凝胶作为异物引起机体较剧烈免疫炎症反应，而NF-κBp65、TNF-α参与了这种乳腺局部免疫炎症反应及纤维组织增生，且两种细胞因子在反应过程中可能存在相互作用，共同促使注射物周围囊壁组织、肿块或炎性反应的发生等。聚丙烯酰胺水凝胶注射后NF-κBp65、TNF-α的相互作用，刺激机体产生免疫应答反应，从而产生一系列并发症。

[参考文献]

[1]陈伟华,王林,吕远东,等.双平面法隆乳术治疗聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳术后并发症[J].中华整形外科杂志,2006,22(6):424-426.

[2]周智,柳大烈,鲁开化,等.聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳并发症的研究及防治方法及分析[J].中国实用美容整形外科杂志,2005,16(16)：353-356.

[3]InnocentiM,ThoresonAC,FerreroRL,et al.Helicobacter pylori- induced activation of human endothelial cells[J].Infect Immun,2002,70(8):458

[4]Andy Wullaert,et al. NF-κB in the regulation of epithelial homeostasis and infammation[J]. Cell Research, 2011, 21:146-158.

[5]孙宝东,刘定华.聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳并发症患者外周血淋巴细胞亚群特点研究[J].中国美容医学,2007,16(10):1340-1342.

[6]余敏,孙圣荣,张娟.亲水性聚丙烯酰胺水凝胶隆乳术后对乳腺细胞免疫功能影响的观察[J].中华肿瘤防治杂志,2011,18(6):436-438.

[7]马蕊,陈振雨,李慧超,等.聚丙烯酰胺水凝胶注射隆乳术后乳腺组织免疫应答及细胞增殖的变化[J].第二军医大学学报,2008,29(5):509-512.

[8]晏培松,鲁开化.聚丙烯酰胺水凝胶注入兔体后组织病理学与免疫组化的动态观察[J].中国美容整形外科杂志, 2006,17(5):395-398.

[9]张宝玉,李金凤.细胞核转录因子在不同乳腺组织中的检出结果[J].实用医药杂志,2005,22(11):1003.

[10]Scheinfeld N. A comprehensive review and evaluation of the side effects of the tumor necrosis fact or alpha blockers etanercept,infliximab and adali mumab[J].J Dermatolog Treat,2004,15 (5):280-294.

[收稿日期]2014-03-15[修回日期]2014-04-30

编辑/张惠娟