多西环素对大鼠正畸移动牙根面骨型胶原酶表达的影响

张志菲 刘月华

[摘要]目的：通过建立正畸牙根吸收动物模型，检测牙根面及根周组织中骨型胶原酶（MMP-13）的分布和表达，研究多西环素（DOXY）对根吸收及骨型胶原酶表达的影响。方法：选用SD大鼠36只建立正畸牙移动根吸收的动物模型，随机分为空白对照组、注射DOXY对照组、正常牙加力组、注射DOXY加力组。在加力的0天、7天、10天、14天分别处死各组大鼠。并取相应时段的标本制作组织切片，应用免疫组化技术检测分析各组中骨型胶原酶（MMP-13）在第一磨牙根吸收组织中的定位表达，检测多西环素对根周组织内骨型胶原酶表达及分布的影响。用计算机图像分析技术定量比较上述试验结果。结果：在多西环素的影响下，在第7天和第10天给药受力组的MMP-13 的阳性表达低于受力不给药组。给药受力组MMP-13的阳性表达在第10天更低（P<0.01）。两实验组MMP-13 的阳性表达都在第10天到达峰值后第14天趋于平稳。结论：多西环素可能作为骨型胶原酶的抑制剂对破骨细胞的募集及牙根吸收有抑制作用。

[关键词]牙根吸收；多西环素；正畸牙齿移动；骨型胶原酶

[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2014）09-0734-05

An experimental study on expression of collagenase-3 during orthodontic tooth movement in rats with doxycycline administration

ZHANG Zhi-fei1,LIU Yue-hua2

(1.Department of Stomatology, Luwan Branch, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200020,China;2.Department of Orthodontics, School of Stomatology,Tongji University, Shanghai 200072, China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and the localization of MMP-13 in root-resorbing tissue during experimental tooth movement with doxycycline(DC) administration, to elucidate the protein changes and mechanism of root resorption induced by orthodontic tooth movement. All of these could give an evidence which maybe used regulate orthodontic tooth movement more efficiently.MethodsAnimal models of experimental orthodontic tooth movement in Sprague-Dawley rats were established. 36 male rats were randomly assigned to four groups.Nine animals served as untreated controls. Nine animals were only administered DC for 7 days, by means of injection on rat's back subcutaneously daily.In 18 animals the maxillary first molar was moved mesially by a continuous and constant reciprocal force of 50g from Sentalloy? closed-coil springs. In 9 of these animals DC was administered at the time of appliance insertion and throughout the experiment.The animals were sacrificed 7,10 or 14 days after force application. An area including the mesial aspect of the mesial root and the adjacent interradicular alveolar bone was histomorphometrically evaluated.The expression and localization of MMP-13 were examined by immunohistochemical technology. Computer image analysis was performed to evaluate all of these results.ResultsThe expression of MMP-13 presents a peak at day 10 and decreased at day 14. The doxy-ortho group demonstrated significantly fewer MMP-13- positive cells on the root surface than the ortho group at day 7 and day 10.ConclusionAs an effective collagenase inhibitor, DC may have an inhibitory effect on the recruitment of osteoclasts and orthodontically induced resorptive activity.

Key words:root resorption;doxycycline;orthodontic tooth movement;MMP-13

一直以来，正畸牙齿移动根吸收的生物学机制深受学者们关注。研究显示，根吸收过程与骨吸收类似，而骨吸收包括两个过程：矿物质的溶解和有机质的降解，有机质主要由胶原构成，而胶原的降解主要通过蛋白酶，特别是基质金属蛋白酶（MMPs）和溶酶体酶完成。已证实MMPs几乎在机体各种组织的发育和修复、炎症反应等过程发挥着重要作用。其中早有研究显示在乳牙的生理性根吸收过程中，MMPs起到了关键作用[1]。MMP-13亦称骨型胶原酶、胶原酶-3，与胶原酶-1（MMP-1）、胶原酶-2（MMP-8）同属MMPs家族中的胶原酶组 。Hiroaki Nakamura等的研究显示，MMP-13在骨基质胶原的降解中起到了重要作用[2]。MMP-13在正畸移动牙根吸收过程中的胶原降解中是否也扮演着同样重要的角色呢？四环素类药物，是一种广谱抗生素，它的化学修饰同类物已经被用于临床辅助治疗牙周病。有研究显示在牙体牙髓治疗中局部应用多西环素能抑制炎性根吸收以及牙外伤导致的炎性牙槽骨吸收[3]，多西环素对大鼠正畸移动牙根吸收组织内胶原酶的活性是否也有抑制作用呢？本实验采用SD大鼠建立正畸牙齿移动根吸收模型，使用免疫组化染色法观察和比较在多西环素影响下，不同加力时间组根吸收组织中MMP-13的表达与分布的变化。

1材料和方法

1.1 动物模型的建立：选取36只健康雄性SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司），体重220g左右，随机分为空白对照组、注射DOXY对照组、正常牙加力组、注射DOXY 加力组，每组9只。各受力组均使用Sentalloy R关闭弹簧（50g力，GAC，NEWYORK，NY，USA）使上颌一侧第一磨牙在50g持续恒定力值的作用下向近中移动。各给药组均每天经皮下给以盐酸多西环素（上海天田科技有限公司），每天给药的剂量是0.24mg/天，（1.2mg/kg体重/天），在实验的第7天处死全部对照组大鼠，加力组大鼠则于第7天、10天、14天分别处死各组大鼠，3只/每组/每次。并取相应时段的受力侧第一磨牙及其周围组织标本制作组织切片，进行组织学分析。各组动物分笼饲养，自由摄食饮水，采用自然光源饲养条件。

1.2 实验大鼠各组标本制备：分别于第7、10、14天过量麻药处死各组大鼠，取实验大鼠上颌骨实验侧磨牙及其周围组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后用蒸馏水漂洗1分钟，放入乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙剂中，4℃下，脱钙6～8周，去除多余组织块，保留磨牙及其周围组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸渍包埋。将标本按牙齿移动近远中矢状方向通过牙齿中央窝脊髓腔的中轴层面连续切片6张，各位5μm厚，裱于经氨丙基三乙氧基硅烷（APES）处理过的玻片上，选用连续切片4张，行免疫组织化学染色，细胞形态完整，结构清晰，细胞中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.3 图像分析：采用Axioplan 2多功能全自动显微镜对切片进行观察，Nikon Eclipse E600数码相机进行图像采集，Motic Images Advanced(Ver.3.2)图像分析软件进行统计学分析。取免疫组化切片，每张切片在第一磨牙近中颊根近中面压力侧牙根中1/3处任意选择三个区域，以交互方式进行测量分析，选用参数为面积百分比（百分比=阳性细胞数/一个高倍视野镜下细胞总数）。以三次测量值的均值作为该动物在此时间点的实测值。

1.4 数据统计分析：所有数据均使用SPSS 13.0统计软件采用单因素方差分析比较不同实验组、不同时间段实验结果的差异。以 P<0.05 表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有高度统计学意义。

2结果

2.1 不给药组压力侧牙周组织内MMP-13的表达与分布：在空白对照组：生理状态下，MMP-13 呈弱阳性表达，在临近骨吸收处的骨细胞呈现MMP-13免疫反应阳性。如图1.1。

在受力不给药组：实验组大量细胞呈现MMP-13免疫反应阳性，主要集中在根吸收和骨吸收处。在骨吸收区，MMP-13免疫反应阳性主要出现在破骨细胞下的骨表面，在一些骨细胞及其陷窝处也呈阳性，而且阳性的骨细胞趋向于靠近破骨细胞，但破骨细胞本身不呈阳性。在骨吸收区的骨表面的成骨细胞和靠近破骨细胞的成纤维细胞也显示阳性。而在根吸收区，临近破牙细胞的成牙骨质细胞和成纤维细胞呈现阳性，但破牙细胞不显示阳性。如图1.2、1.3、1.4

2.2 不给药组压力侧牙周组织内MMP-13表达的时相性变化：正常条件下，大鼠磨牙存在生理性的远中漂移，因而其牙根的远中侧可见MMP-13的弱阳性表达，见图2.1。加力后，磨牙向近中移动，因而其牙根的近中侧可见MMP-13的阳性表达，见图2.2。大鼠在加力10天后，牙周组织内的MMP-13表达出现峰值，呈强阳性表达，见图2.3。第14天则表达趋于平稳，见图2.4。方差分析显示，大鼠加力后第7天MMP-13的阳性率显著高于未加力时，加力后10天的阳性率显著高于其他各时间点（P<0.01）。见表1，图3.1。

2.3 各受力组压力侧牙周组织内MMP-13表达的时相性变化：在各受力组，第7天和第10天给药受力组的MMP-13 的阳性表达低于受力不给药组。给药受力组MMP-13 的阳性表达在第10天明显更低（P<0.01）。两实验组MMP-13 的阳性表达都在第10天到达峰值后第14天趋于平稳（见表1，图3.2、3.3、3.4、3.5）。

3讨论

正畸牙齿移动过程中的牙槽骨和牙周膜的改建是一个较特殊的过程。MMPs在骨改建过程中发挥了不可替代的作用，在正常骨组织中，MMPs由多种细胞以酶原的形式合成分泌。骨基质的正常生理代谢依赖于MMPs及其抑制因子两者之间的平衡关系[4]。当骨组织受到外来刺激或病变时，破骨细胞、成骨细胞和成纤维细胞合成分泌MMP酶原，MMP酶原在细胞外受多种激活机制作用而被激活。这些蛋白酶根据作用底物特异性在骨改建的不同阶段对降解胞外基质起着关键作用。而破骨细胞，成骨细胞在行使破骨、成骨功能及迁移运动时依赖MMPs对骨基质的主要成份胶原的裂解。胶原酶不仅直接参与破骨细胞的骨吸收过程，而且是成骨细胞诱导破骨细胞骨吸收的中介因子之一。

MMP-13是胶原酶中的一种，又称胶原酶-3或骨型胶原酶，其在各种组织的细胞外基质的降解过程中都发挥了重要作用[2]。与其他MMPs相比，MMP- 13在骨基质降解过程中起了尤为重要的作用，Pivetta E[5]的研究也证实了这一观点。牙根吸收与骨吸收具有一定的可比性，破牙细胞和破骨细胞形态相似，而且成牙骨质细胞、牙骨质细胞与成骨细胞、骨细胞在功能上几乎是同一的[6]。笔者推断MMP-13在牙根吸收也扮演了与骨吸收中类似的重要角色。本实验的研究结果显示：在生理状态下，MMP-13弱阳性表达，说明MMP-13参与了牙周组织的生理性改建。

本实验的研究结果显示在骨吸收区，MMP-13免疫反应阳性主要出现在破骨细胞下的骨表面，在一些骨细胞及其陷窝处也呈阳性，而且阳性的骨细胞趋向于靠近破骨细胞，但破骨细胞本身不呈阳性。在骨吸收区的骨表面的成骨细胞和靠近破骨细胞的成纤维细胞也显示阳性。而在根吸收区，临近破牙细胞的成牙骨质细胞和成纤维细胞呈现阳性，但破牙细胞不显示阳性。这也与Morrison C[7]等人对MMP-13的实验研究结果基本吻合，这进一步验证了MMP-13不是来自于破骨细胞而是来自于成骨细胞。

Holliday等[8]发现在胶原酶抑制剂存在的条件下，破骨细胞的骨吸收作用明显被抑制。这表明邻近破骨细胞的基质细胞和成骨细胞通过释放大量胶原酶产生胶原质片段从而激活破骨细胞的骨吸收作用。Sato等[9]将纯化的破骨细胞分别培养于涂或未涂胶原的骨片上，在未涂胶原的的骨片上MMPs抑制剂未能抑制骨陷窝的形成，而在涂有胶原的骨片上，MMPs抑制剂有效的抑制了骨陷窝的形成。使用其他类的蛋白酶抑制剂没有出现这种现象，这说明胶原酶不仅直接参与骨基质的降解，而且破骨细胞、成骨细胞在行使破骨、成骨功能及迁徙运动时还依赖于胶原酶的介导。

MMP-13不但能够降解I、II、III型胶原，而且还是其他MMPs的激活剂。MMP-1、MMP-8、MMP-13只能够把胶原纤维降解到其原始分子大小的1/4～3/4，而只有MMP-9能够进一步把胶原纤维降解到更小的分子量。Knauper V等的研究就发现MMP-13在基质降解过程中，不仅能够有效地降解I型胶原，而且还能够有效地激活MMP-9[10]，从而使细胞外基质充分降解。

骨吸收与根吸收起始于骨/根表面未矿化的类骨质层的降解，由成骨细胞和成牙骨质细胞合成分泌的胶原酶可以降解骨表面的类骨质，导致骨/根吸收的开始。因而胶原酶在根吸收的发生过程中起到了关键作用。胶原酶是一组锌和钙依赖的内源性肽酶，它的活化需要与Ca等金属阳离子结合。多西环素（DOXY）是由土霉素经6-α位脱氧得到的一种半合成抗生素，是一种金属鳌合剂，可竞争性与Ca 等金属阳离子结合，抑制胶原酶活化，从而减少活性胶原酶合成，减少细胞外基质的降解。DOXY可与牙骨质结合，缓慢释放，较长时间地维持抗胶原酶活性[11]。

Lee HH[12]等人通过实验研究发现多西环素能够有效的抑制胶原酶活性，从而抑制骨基质的降解。Bedi A等[13]的研究指出多西环素能通过抑制MMPs活性而抑制大鼠结缔组织降解。Tüter G[14]等的研究发现多西环素能抑制牙周病患者龈沟液中的胶原酶活性进而帮助抑制牙周炎的进展。本实验运用SD大鼠建立动物模型，观察多西环素对大鼠正畸移动牙根吸收组织内胶原酶活性的抑制情况。在本研究中，第7天和第10天给药受力组的MMP-13 的阳性表达低于受力不给药组。给药受力组MMP-13 的阳性表达在第10天明显更低（P<0.01）。组间差别有统计学意义，这说明多西环素对大鼠根吸收组织内MMP-13的表达有抑制作用。

综上所述，本实验揭示由成骨细胞分泌释放的骨型胶原酶（MMP-13），能够降解破坏根表面有机质中的胶原纤维，并激活其他MMPs，协同作用使有机质层下的矿物质成份暴露；同时还能诱导破骨细胞分化和活化，从而最终导致了根面的破骨性吸收。而多西环素也可能主要是通过抑制破骨细胞功能和胶原酶的活性来抑制根吸收的发生。然而，这些药物在抑制不利根吸收发生的同时，是否也会抑制正畸牙齿移动过程中的有利破骨活动呢？如何权衡两者之间的利弊问题等等，这都还有待于进一步的研究。

[参考文献]

[1]Linsuwanont-Santiwong B,Takagi Y,Ohya K,et al. Expression of MT1-MMP during deciduous tooth resorption in odontoclasts[J].J Bone Miner Metab,2006,24(6):447-453.

[2]Hiroaki Nakamura,Ginga Sato,Azumi Hirata,et al.Immunolocalization of matrix metalloproteinase-13 on bone surface under osteoclasts in rat tibia[J].Bone,2004,34:48-56.

[3]Mohammadi Z.Local applications of tetracyclines in endodontics and dental trauma: a review. [J].Dent Today,2009,28(1):95-96,98,100-101.quiz 101.

[4]Johansen JS,Williamson MK,et al.Identification of proteins secreted by human osteoblastic cells in culture[J].J Bone Miner Res,1992,7(5):502-512.

[5]Pivetta E,Scapolan M,Pecolo M,et al.Spessotto P.MMP-13 stimulates osteoclast differentiation and activation in tumour breastbone metastases[J].Breast Cancer Res,2011,27,13(5):R105.

[6]Holmes SG,Still K, Buttle DJ,et al.Chemically modified tetracyclines act through multiple mechanisms directly on osteoclast precursors[J].Bone,2004,35:471-478.

[7]Morrison C,Mancini S,Cipollone J,et al.Microarray and proteomic analysis of breast cancer cell and osteoblast co-cultures:role of osteoblast matrix metalloproteinase (MMP)-13 in bonemetastasis[J].J Biol Chem, 2011, 30,286(39):34271-34285.

[8]Holliday LS,Welgus HG,et al.Initiation of osteoclast bone resorption by interstitial collagenase[J].J Biol Chem,1997,272(35):22053-22058.

[9]Sato T,Foged NT,Delaisse JM.The migration of purified osteoclasts through collagen is inhibited by matrix metalloproteinase inhibitors[J].J Bone Miner Res,1998,13(1):59-66.

[10]Knauper V,Smith B, Lopez-Otin C,et al.Activation of progelatinase B (proMMP-9) by active collagenase-3 (MMP-13)[J].Eur J Biochem,1997,248:369-373.

[11]樊明文.口腔生物学[M],2版.北京:人民卫生出版社,2004:320-324.

[12]Lee HH,O'Malley MJ,Friel NA,et al. Effects of doxycycline on mesenchymal stem cell chondrogenesis and cartilage repair[J].Osteoarthritis Cartilage,2013,21(2):385-393.

[13]Bedi A,Fox AJ,Kovacevic D,et al.Rodeo SA.Doxycycline-mediated inhibition of matrix metalloproteinases improves healing after rotator cuff repair[J].Am J Sports Med,2010,38(2):308-317.

[14]Tüter G,Serdar M,Kurtis B,et al.Effects of scaling and root planing and subantimicrobial dose doxycycline on gingival crevicular fluid levels of matrix metalloproteinase-8,-13 and serum levels of HsCRP in patients with chronic periodontitis[J].J Periodontol,2010,81(8):1132-1139.

[收稿日期]2014-03-28[修回日期]2014-05-05

编辑/张惠娟