自体脂肪移植及其血管生成的研究进展

高扬 伍尚敏

严重的烧伤[1]、创伤或正常情况下的美容手术都有进行脂肪组织移植的需求，但脂肪移植在供区[2]和受区位点仍然存在一定的限制或可能会发生一些并发症；而自体脂肪组织作为软组织修复重建的材料之一，其具有来源丰富、取材方便、无免疫排斥反应等特点。自体脂肪移植后因血供不足导致脂肪移植组织被吸收和脂肪细胞凋亡是影响自体脂肪移植存活率的关键。以自体颗粒脂肪移植或脂肪组织工程学为主的许多研究已经证明了影响自体脂肪移植最重要和最关键的因素是新生血管的质量、数量和新生脂肪组织的长期存活率[3]。

1关于脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cell, ASC）的研究应用

尽管具有无法预测的临床结果和低移植存活率，但自体脂肪组织已被用作软组织缺陷的潜在填充材料。有报道显示，ASCs通过促进血管生成在脂肪移植组织存活率方面起到了举足轻重的作用[4]。含有脂肪来源干细胞的自体脂肪组织移植通过增加血管再生提高了脂肪移植组织的质量和存活率，是一种有效的替代治疗方法。ASCs的早期作用是诱发新血管从受区向周围生长并释放大量的血管生长因子到脂肪移植组织,且该效应在缺氧环境下增强。脂肪组织血管再生是自体脂肪移植的关键一步，因为血管生成不足导致脂肪移植组织在体内被吸收。解决这方面问题的一个可能方法是，联合植入ASCs和内皮细胞到受区，以刺激血管网形成。为此，Strassburg等[5]将分别取自人体腹部的ASCs和人体外周血的内皮祖细胞（EPCs）进行联合培养，用以刺激受精鸡卵绒毛尿囊膜（CAM）的纤维蛋白结构血管化，并与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行直接对比。经过9天的孵化，细胞-纤维蛋白结构向外延伸，并从组织学上评估鸟类血管向内生长形成相关结构和人类血管的生成。可得出，通过联合植入人类内皮细胞，ASCs成功地引导主要血管转化为相应结构（血管化）和毛细血管样结构形成。由于人类脐静脉内皮细胞优于EPCs，因此形成了纤维蛋白结构的鸟类和人类毛细血管网。以上实验表明：利用自体颗粒脂肪移植的脂肪来源干细胞和内皮细胞之间的相互作用能促进血管生成。

2血管基质(Stromal vascular fraction, SVF)的研究

脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后，可得到血管基质部分（SVF），这种血管基质含有多向分化潜能的多功能细胞（脂肪来源干细胞）。因此，Luan等[6]从C57BL/6J-GFP小鼠分离得到SVF并进行绿色荧光蛋白染色，再从C57BL/6J小鼠腹股沟处切取脂肪组织后剁碎，并与绿色荧光蛋白阳性的SVF混合，然后一起植入BALB/c小鼠。运用荧光成像技术探测植入的绿色荧光蛋白阳性的血管基质部分细胞的存活情况，持续监控56天；接着运用免疫荧光染色技术分析第7、14、28、35、 42和56天缺血脂肪组织中的绿色荧光蛋白阳性的SVF的分化情况。荧光信号强度在共同植入的第14天出现大幅度下降，并持续下降，在第56天有17.3%的信号强度（相对于第1天）。免疫荧光染色揭示了一些绿色荧光蛋白阳性细胞从第7天开始能自发性分化成脂肪组织，一些植入的SVF能合并成新生血管。该实验揭示了SVF参与脂肪移植的血管再生和形成，并表现出了多态性改变。Lu等[7-8]研究发现：SVF通过分泌促进脂肪组织再生的生长因子，促进血管再生，增加脂肪来源干细胞的密度，提高了移植物的存留率。以上实验研究表明，通过自体颗粒脂肪移植，SVF对自体脂肪移植组织的血管再生起到促进作用，值得继续研究和探讨。

3M2巨噬细胞对SVF的辅助作用

由前面研究可知，SVF能通过增强血管再生极大地提高了脂肪移植组织的存活率。然而，在脂肪移植早期阶段，由于急性缺氧，导致巨噬细胞聚集。Dong等[9]研究发现血管基质部分细胞很少能保留到SVF协助脂肪组织移植的后期；而M2巨噬细胞通过充当血管再生信号源增强脂肪移植组织的血管再生，促进端细胞迁移，并协助端细胞融合。由M2巨噬细胞创造的血管再生和抗炎的微环境可刺激浸润性巨噬细胞向M2巨噬细胞转化，这些M2巨噬细胞可通过促进血管再生增加脂肪移植组织的长期保留。基于此，可推断M2巨噬细胞能辅助血管基质部分细胞保持其长期血管再生效应，M2巨噬细胞与脂肪移植组织的微血管形成可能有联系。以上的研究和分析使我们对M2巨噬细胞有了新的认识，也启发了我们对SVF辅助脂肪组织移植机制的理解。

4关于富血小板血浆（Platelet-rich plasma, PRP）的应用

富血小板血浆是通过离心自体全血而获得的血小板浓缩物。因PRP可来源于自体，其获取简便，无免疫排斥反应，并发症少，研究证实，PRP还具有使脂肪间充质干细胞增殖和分化的作用。国内外已有将PRP应用于颅面及皮肤软组织修复等的研究报道。Li等[10]从一成年女性大腿外侧提取脂肪组织并制备成PRP，向实验组12只雌性裸鼠背部两侧皮下层各注入0.8ml脂肪组织-PRP混合液（10:2），向对照组12只雌性裸鼠背部两侧皮下层则注入0.8mL脂肪组织-生理盐水混合液（10:2）。5天后，将0.14ml活化的脂肪组织注入实验组；10天后，将0.14ml生理盐水注入对照组。在15、30、90和180天后，获取样本做总量和组织学观察。结果发现：移植组织无炎症和脓肿形成；实验组在血管再生、脂肪液化和坏死方面都要好于对照组；在15、30和90天后，实验组的移植脂肪的重量和体积均显著大于对照组(P<0.05)，但在180天后，两组没有显著差异(P>0.05)。组织学观察得出：实验组显示出了良好的形态学，均匀的脂肪，增加的液泡，无坏死和钙化；对照组则显示为无序分布，明显的坏死和钙化，实验组坏死区域的比例显著低于对照组(P< 0.05)；在15、180天后，实验组的微血管数量显著多于对照组(P<0.05)。实验结果表明：在180天内，反复利用PRP辅助脂肪移植能明显提高脂肪移植组织存活率和移植组织质量。Willemsen 等[11]做了24例富血小板血浆自体脂肪的双侧臀部移植，通过吸取临近区域的脂肪获取轮廓形状。记录术后结果和并发症，并通过问卷调查来获取患者的满意度和结果。平均随访时间为44个月，双侧脂肪移植量是481cc，术后随访期间无血肿、感染和其他并发症发生，恢复快。因此，臀部的PRP脂肪注入术是安全有效的，其具有低并发症和持续稳定性。以上研究表明PRP混合自体颗粒脂肪组织移植能加速移植组织早期血管重建，避免纤维化和脂肪细胞凋亡，另一方面，制作简单，降低了医疗成本，减轻了患者的经济负担，且对患者损伤较小，恢复快，颇具深入研究的临床意义。

5关于透明质酸（Hyaluronan，HA）水凝胶的应用

透明质酸作为一种细胞外基质，被广泛运用于美容修复领域，具有修复软组织缺损的功能，研究发现，HA还具有促脂肪移植组织血管再生的作用。Alghoul 等[12]从27只大鼠的腹股沟获取脂肪组织处理后，注入到动物们的背部皮下形成2个移植组织块：1个仅包含脂肪，另1个包含脂肪和透明质酸水凝胶的混合物（1:1）。分别在第4、12和20周将它们安乐死，运用高分辨率计算机断层扫描这些活体内的移植组织，并计量两种移植组织的体积。之后进行组织学研究并评估脂肪坏死和血管密度。结果发现：所有的移植组织都能存活，和仅包含脂肪的移植组织相比，包含脂肪和HA的移植组织的脂肪坏死有显著性差异（P<0.001）。这种差异在第4周是最显著的(P =0.008)，但在第12周和第20周没有达到统计学意义；在第12周，混合移植组织的血管密度明显高于脂肪移植组织的(P =0.016)，但这在第4周和第20周并没有达到统计学意义；在第20周，混合移植组织的脂肪成分明显比脂肪移植组织有更少的体积丢失(P=0.008)。从而得出，当与脂肪组织混合时，透明质酸水凝胶能提高早期脂肪移植的存活率，增加血管分布并使脂肪体积长期保存。Sarkanen 等[13]将脂肪组织提取物（ATE）和HA混合后注入啮齿动物背部皮下组织。在第1～40周，可观察到局部炎症反应，血管再生和脂肪形成。运用微血管密度分析评估血管再生，运用自动图像分析评估脂肪生成，运用免疫染色评估免疫反应并计数炎性细胞。这种非细胞移植物在移植早期诱导微血管形成，12周以后有脂肪沉积，同时皮下组织体积增大，ATE-HA混合物被拥有毛细血管、神经束和健康结缔组织且无局部炎症反应和囊肿的脂肪组织替代。实验可得出，和简单的HA移植相比，非细胞性的HA水凝胶移植物能显著诱导活体内的脂肪形成和血管再生。以上的研究结果表明，对于软组织的损伤或出于美容目的自体颗粒脂肪移植，HA水凝胶移植物在血管再生和脂肪形成方面具有积极意义。

6关于生长因子的应用

6.1血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)的应用研究:血管内皮生长因子（VEGF）可在体内诱导血管再生，在自体脂肪移植中，很多学者运用了脂肪组织工程技术[14]，取得了不错的成果。Chung等[15]将负载有VEGF的胶囊化的微球体（n=6）、空（聚乳酸-乙醇酸共聚物）微球体(n=6)的人类脂肪提取物和人类脂肪提取物(n=6)分别从皮下注入到无胸腺裸鼠的两侧。每组处死3只裸鼠，移植组织分别在第3周和第6周被取出，结果显示VEGF样本组的质量和体积都有增加，另两组则都减少，在第6周达到统计学意义。CD31+、伊红和苏木精成像显著，则证明了VEGF样本组比另两组有更多的血管形成。Yi等[16]利用腺病毒做VEGF的载体，并混合人类脂肪组织后注入到实验动物头皮下。两组对照组则分别注入绿色荧光蛋白基因-人类脂肪组织混合物和生理盐水。经过一系列处理后，实验结果显示实验组的毛细血管密度显著增高（P<0.01），其脂肪移植组织的重量和体积明显高于对照组(P<0.05)。Lei等[17]利用编码VEGF的质粒混合脂肪组织后植入小鼠，实验证明VEGF促进了移植体血管再生并减少了脂肪的吸收。以上研究运用脂肪组织工程技术，显示了VEGF在自体脂肪移植方面发挥着促血管再生作用，进而使脂肪移植组织被吸收量减少。

6.2红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）：前面讨论富血小板血浆对自体脂肪移植存活率的影响，进而提出了红细胞生成素是否对移植组织的血管再生等有促进作用。Hamed等[18]将人类脂肪组织注入到免疫受损的裸鼠皮下，然后用20或100UI EPO处理移植组织。15周的研究期结束后，在血管再生、细胞凋亡和组织学范围内评估脂肪移植组织，将实验结果和血管内皮生长因子（VEGF）处理过的及磷酸盐缓冲盐水 (Phosphate buffered saline,PBS)处理过的移植组织作比较。实验结果显示，EPO处理过的移植组织的重量和体积比PBS处理过的更大，PBS处理过的移植组织的重量和体积不同于VEGF处理过的移植组织；利用EPO也增强了血管生成因子的表达，增加了微血管的密度，减少了炎症和细胞凋亡。综上所述，EPO可能也是自体颗粒脂肪移植组织血管再生机制的一个影响因素，目前国内外对这方面的研究不多，值得继续研究和探讨。

7小结

无论是运用自体颗粒脂肪移植或是脂肪组织工程技术，都是以增加脂肪移植存活率为目的，且日益受到国内外学者的重视。以上总结了近年来较有潜力的促自体脂肪移植组织血管再生的物质及其研究方法。还有一些活性物质，如白细胞介素-8[19]、碱性成纤维细胞生长因子[20]、胰岛素[21]、人工脂肪替代物[22]等正处于继续研究之中。到底有多少活性物质有促进脂肪移植组织血管再生的能力，这些活性物质之间是否存在协同或拮抗关系，生物工程材料是否能代替自体脂肪组织，技术手段的革新，这些都值得我们继续研究和探讨。

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[收稿日期]2014-04-08 [修回日期]2014-04-30

编辑/李阳利