利用组合策略提高汉逊酵母发酵生产D—阿拉伯糖醇

钱卫东 宁肖肖 赵德志等

摘要[目的]提高多形汉逊酵母发酵生产D阿拉伯糖醇的产量。[方法]通过正交试验确定了用多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇发酵培养基的最佳组分，进而结合培养温度对发酵过程的影响，获得运用变温策略提高多形汉逊酵母生产D阿拉伯糖醇的方法。[结果]最优发酵培养基组分为：葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，Triton X100 10 g/L，硫酸铵3.0 g/L，七水硫酸镁2.5 g/L，磷酸二氢钾2.5 g/L；多形汉逊酵母DL1的最适生长温度和D阿拉伯糖醇最适合成温度分别为37 ℃和34 ℃；變温调控发酵方法为：将发酵培养基在37 ℃培养24 h后，升温到48 ℃继续培养24 h，再降温至34 ℃继续培养96 h得到发酵液。采用该方法发酵结束后D阿拉伯糖醇产量为114.92 g/L，比恒温发酵（37 ℃、48 ℃、34 ℃）分别提高了30.25%、208.66%、20.93%。[结论]该方法可以提高多形汉逊酵母发酵生产D阿拉伯糖醇。

关键词 D阿拉伯糖醇，多形汉逊酵母DL1，正交试验，变温调控

中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）23-07726-03

基金项目国家自然科学基金项目“利用超远缘遗传转化酵母技术解析龙胆苦苷生物合成关键酶基因”（31100040）；陕西省教育厅项目“利用酵母全合成抗癌药物紫杉醇的研究（2013JK0727）”。

作者简介钱卫东（1980-），男，安徽芜湖人，讲师，博士，从事功能性酵母开发方面的研究。

收稿日期20140710D阿拉伯糖醇是一种五碳多元糖醇，在机体内的代谢与胰岛素无关，是一种重要的功能性食品基料[1]。目前的主要生产方法有提取法、化学合成法及生物法[2]。

生物法具有成本低，易于操作，节能环保等特点。发酵法生产D阿拉伯糖醇常用的菌株一般都是耐高渗酵母。耐高渗酵母在高渗环境中能够代谢产生多元糖醇，保护高渗条件下的细胞[3]。目前用于生产D阿拉伯糖醇的主要菌株有汉逊酵母属（Hansenula）[4]、毕赤酵母属（Pichia）[5]、假丝酵母属（Candida）[6]、接合酵母属（Zygosaccharomyces）[7]、德巴利氏酵母属（Debaryomyces）[8]。宋卫斌[9]从花粉中筛选获得了1株D阿拉伯糖醇产量为86.55 g/L的高产菌株，分析鉴定属于假丝酵母属。唐晓芳等[10]对Hansenula anomala转化葡萄糖生产D阿拉伯糖醇的反应条件进行了研究，在最佳工艺条件下D阿拉伯糖醇浓度为245.97 g/L，转化率为0.49 g阿拉伯糖醇/g葡萄糖。李泽[11]从高渗环境中筛选出1株D阿拉伯糖醇的高产菌株，并对发酵工艺进行优化，在最佳工艺条件下进行发酵，D阿拉伯醇的产量能达到60.6 g/L，葡萄糖转化率为 26.11%。蔡利等[12]从高糖环境中筛选出一株D阿拉伯糖醇产量为54.65 g/L的高产菌株，命名为Kodamaea ohmeri NH9。尤翠萍等[13]研究了表面活性剂对得巴利汉逊酵母发酵生产D阿拉伯糖醇的影响，结果发现，Triton X-100对D阿拉伯糖醇的生产具有显著的促进作用。

汉逊酵母属中的多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）是当前国际公认的理想细胞工厂之一[14]。多形汉逊酵母DL1是一种耐热酵母（可在49 ℃条件下正常生长），培养温度较高，细胞生长代谢速度较快，相对较高的培养温度有利于降低冷却成本和大规模培养时的污染可能性。多形汉逊酵母可以在廉价的非选择性培养基中生长，易于高密度发酵，具有广泛的研究价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种。多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha，H.polymorpha）DL1（ATCC No.26012）菌株，由中国科学院微生物研究所邱并生研究员惠赠；陕西科技大学制药工程实验室保藏。

1.1.2 培养基。 斜面培养基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂15 g/L，pH 6.0。

种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 ，pH 6.0。

高渗固体培养基：葡萄糖500 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，琼脂15 g/L，pH 6.0。

1.2试验方法

1.2.1 培养方法。

1.2.1.1菌株预培养。 将斜面保藏的种子在37 ℃活化3 h后，挑取一个单菌落接种至装有5 ml种子培养基的试管，37 ℃、160 r/min，振荡培养24 h得种子液。将培养好的种子液涂布于葡萄糖含量为500 g/L的高渗固体培养基，置于37 ℃恒温培养48 h；挑取生长较好的单菌落接种至种子培养基中进行种子培养，37 ℃、160 r/min，振荡培养24 h得种子液。重复此步骤驯化3次后，挑选生长较大的单菌落涂布在高渗固体斜面保藏。

1.2.1.2种子培养。 将驯化后的种子在37 ℃活化3 h后，挑取一个单菌落接种至装有100 ml种子培养基的250 ml三角瓶中进行种子培养，37 ℃、160 r/min，振荡培养24 h得种子液。

1.2.1.3发酵培养基优化。以葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、Triton X100、硫酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钾的添加量为考察因素，根据文献报道设置不同水平，运用正交试验确定最佳发酵培养基配方。在温度37 ℃、接种菌龄24 h、接种量5%、摇床转速160 r/min、发酵时间144 h的条件下，进行7因素3水平正交试验设计，具体设计见。发酵结果经极差和方差分析，找出各培养基成分的最佳浓度。

正交试验设计g/L

水平因素葡萄糖（A）蛋白胨（B） 酵母浸粉（C） Triton X-100（D） 硫酸铵（E）七水硫酸镁（F）磷酸二氢钾（G）115018863.02.52.522002010103.53.03.032502212144.03.53.5

1.2.1.4 变温发酵培养。 将发酵培养基在37 ℃、160 r/min培养24 h后，升温到48 ℃继续培养24 h，再降温到34 ℃继续培养96 h得发酵液，每隔24 h取样分析。每组试验设计3组平行对照，取试验结果的平均值。

1.2.2 分析测定方法。

1.2.2.1 细胞干重测定。 将10 ml发酵液8 000 r/min离心10 min后用蒸馏水洗涤2次得到的细胞在80 ℃下烘至恒重，称重。

1.2.2.2 D阿拉伯糖醇产量和葡萄糖残留量的测定。 取新鲜发酵液50 ml，8 000 r/min离心10 min，取上清，用微孔滤膜过滤。检测条件：色谱柱SH1011；柱温50 ℃；进样量5 μl；流动相0.01 mol/L H2SO4；流速0.8 ml/ min；示差检测器，根据保留时间分析D阿拉伯糖醇产物和葡萄糖底物的浓度。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基优化 发酵培养基优化分析结果见和3。由可知，各因素的极差顺序为RA>RD>RB>RF>RC>RG>RE，极差R值越大，其对D阿拉伯糖醇产率影响越大。因此，影响因子的先后顺序为：葡萄糖>Triton X100>蛋白胨>七水硫酸镁> 酵母浸粉>磷酸二氢钾>硫酸铵。方差分析结果进一步表明，A（葡萄糖）和D（Triton X100）对D阿拉伯糖醇的产率有显著影响。用多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇的最佳发酵培养基配方为A2B2C3D2E1F1G1，即葡萄糖200 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉12 g/L，聚乙二醇辛基苯基醚10 g/L，硫酸铵3.0 g/L，七水硫酸镁2.5 g/L，磷酸二氢钾2.5 g/L；依照此发酵培养基配方进行发酵验证试验，D阿拉伯糖醇产率可达91.46 g/L。

2.2温度对D阿拉伯糖醇产量的影响

2.2.1 恒温发酵。温度是影响微生物细胞生长以及代谢产物合成的一个重要因素。在发酵前期，温度通過影响培养基的性质进而影响微生物菌体自身的生长；在发酵中后期，温度通过影响目标产物生物合成关键酶的活性进而调控代谢产物的合成。因此在发酵培养过程中，必须保证合适的温度。多形汉逊酵母DL1的最适生长温度是37～43 ℃，最高生长温度可达49 ℃。设置不同温度（30、34、37、40、44、48 ℃）条件下恒温发酵144 h，每隔8 h取样测定菌体生物量及D阿拉伯糖醇产量，以期获得该菌最适的发酵温度，结果见。

正交试验结果

试验

从可以看出，温度对菌体生物量及D阿拉伯糖醇含量有明显的影响。由a可知，培养温度为37 ℃时，细胞生长速率显著增大，40 h菌体开始进入稳定期，细胞干重（DCW）达到最大值（5.32 g/L）；当培养温度为48 ℃时，细胞生长缓慢，延滞期较长。由b可知，培养温度为34 ℃时，D阿拉伯糖醇生成速率最大，发酵结束后D阿拉伯糖醇总量达到95.03 g/L。

温度对菌体生物量和D阿拉伯糖醇产量的影响2.2.2 变温发酵。 从上述试验可以看出，多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇过程中，菌体生长和D阿拉伯糖醇生产的最适温度不同。同时，D阿拉伯糖醇是一种多元糖醇，在抵御高温条件引起的刺激中起着非常重要的作用。因此该试验运用变温控制以满足细胞生长、D阿拉伯糖醇合成以及产生的D阿拉伯糖醇保护机体自身的作用3方面的要求，以提高细胞反应过程中目标产物的量，结果见。

变温调控对D阿拉伯糖醇产量和菌体生物量的影响由可知，37 ℃发酵培养24 h后，升温到48 ℃继续培养24 h，再降温至34 ℃继续发酵96 h，细胞干重和D阿拉伯糖醇产量分别为5.26 g/L和114.92 g/L。细胞干重相比37 ℃（5.32 g/L）和34 ℃（5.09g/L）变化不明显；但相比于48 ℃恒温发酵（3.21 g/L）提高了2.09倍。D阿拉伯糖醇产量相比37 ℃恒温发酵（88.23 g/L）、48 ℃恒温发酵（37.23 g/L）和34 ℃恒温发酵（95.03 g/L）分别提高了30.25%、208.66%、20.93%。这表明，变温发酵培养可以影响菌体细胞的生长和代谢产物的生成，适时的高温刺激可以促使菌体大量合成D阿拉伯糖醇，以应对外界不良环境的变化，达到自我保护的目的。

3 结论

通过对多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇过程的初步研究，根据温度对微生物细胞生长和产物代谢过程的影响，结合细胞生长的最适温度、产物生成的最适温度以及发酵培养基组分的影响，获得了一种提高多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇产量的方法，采用该方法发酵结束后细胞干重和D阿拉伯糖醇产量分别为5.26 g/L和114.92 g/L。D阿拉伯糖醇产量分别比恒温发酵（37、48、34 ℃）提高了30.25%、208.66%、20.93%；细胞干重相比37 ℃恒温发酵和34 ℃恒温发酵变化不明显，相比于48 ℃恒温发酵提高了2.09倍。该研究提供的方法为利用多形汉逊酵母DL1发酵生产D阿拉伯糖醇提供实践依据。

安徽农业科学2014年参考文献

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