叶氏消渴方降血糖最佳配伍及剂量的正交试验分析

霍宇+梁天坚+龚志强

[摘要] 目的 以正交试验分析叶氏消渴方降糖最佳配伍及药量规律，探讨其对糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱的调节作用。 方法 采用高脂饲料喂养结合低剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射复制大鼠糖尿病模型，按L18（37）正交表分为18组不同配伍给药组，另设模型组、二甲双胍组及空白组，共21组，每组12只。每组分别给予受试药物治疗14 d，以血糖（FBG）、血清胰岛素（Ins）、胰高血糖素（GC）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-c）、低密度脂蛋白（LDL-c）有关联的多项指标计算综合评分，对综合评分进行极差与方差分析；验证实验中，另将72只SD大鼠分为最佳组方高、中、低剂量组，模型组，二甲双胍组和空白组6个组，以同样的方法造模并检测指标。 结果 根据综合评分，叶氏消渴方最佳组方配伍主次关系为：生地>知母>石膏>麦冬>白芍>甘草；最佳药量为生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麦冬6 g、白芍9 g、甘草6 g，验证实验结果显示该方对各指标均表现出明显改善作用，除HDL-c外，其余指标与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.01）。 结论 叶氏消渴方在配伍药量为生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麦冬6 g、白芍9 g、甘草6 g时，降糖效果最佳；其可能的降糖机制为改善大鼠体内糖代谢、修复胰岛β细胞、促进胰岛素分泌和调节血脂改善胰岛素抵抗。

[关键词] 叶氏消渴方；正交试验；降血糖；最佳组方

[中图分类号] R914 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0023-06

[Abstract] Objective To investigate the optimal ingredient composition and the dosage of Yeshixiaokefang for the hypoglycemic effect in type 2 diabetic rats. Methods Rat models of type 2 diabetes were made by intraperitoneal injecting low-dose streptozotocin accompanied by feeding high-lipid and high-sugar diet. Based on orthogonal design， rat wererandomly divided into 21 groups （including 18 treatment groups， blank group， melbine group and model group）， 12 in each group according to L18（37） table. Then the rats were givent Yeshixiaokefang for 14 days， and fasting blood glucose （FBG）， Glucagon （GC）， insulin （Ins）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， high-density lipoprotein cholesterol （HDL-c） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-c） were as indicators. Synthesis score of multiple indicators was calculated and the multiple indicators were analyzed by using orthogonal design and variance analysis. In verification test， 72 mice were divided into 6 groups： blank group， melbine group， model group， high dose group， middle dose group and low dose group with 12 in each. Duplicating model and indexes test were followed former methods. Results Based on synthetic sores， the optimum of Yeshixiaokefang was as follows： 30 g Radix Rehmanniae； 9 g Anemarrhenaasphodeloides； 30 g Gypsum Fibrosum； 6 g Ophiopogonjaponicus； 9 g white peony root； and 6 g Glycyrrhiza. The sequence of priority was like： Radix Rehmanniae>Anemarrhenaasphodeloides>Gypsum Fibrosum>Ophiopogonjaponicus>white peony root>Glycyrrhiza. The verification test showed the significant difference （P < 0.01） in carbohydrate and lipid metabolism，the number of FBG in blood， Glucagon （GC）， insulin （Ins）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and low-density lipoprotein cholesterol （LDL-c） compared with model group. Conclusion The effect of Yeshixiaokefang on hypoglycemicis optimal when the dosage of 30 g Gypsum Fibrosum； 9 g Armeniacae Common Anemarrhena； and 30 g Radix Rehmanniae； 6 g Ophiopogonjaponicus； 9 g white peony root； and 6 g Glycyrrhiza. Its hypoglycemicmechanism of which probably lies in the modification of carbohydrate metabolism； accelerating the repair of pancreatic islet β cells； increasing secretion and decreasing decomposition of insulin； regulating lipids metabolism to improve insulin resistance.

[Key words] Yeshixiaokefang； Orthogonal test； Hypoglycemic； Optimal ingredient composition

叶氏消渴方为《临证指南医案》卷六“三消”中治中上焦消渴病的第一方[1]，方中诸药在现代临床治疗糖尿病亦取得良好疗效[2-7]，但在运用科学试验方法来进行配伍及剂量探讨的研究尚无。为了更好地验证叶氏消渴方的降血糖疗效，笔者拟采用正交试验结合标准差系数权重法，计算多项指标的综合评分并进行极差与方差分析，从中筛选出其最优药量配伍并验证其疗效，同时探讨该方干预糖尿病大鼠模型的最佳配伍规律及剂量的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SPF级5周龄雄性SD大鼠，2批分别为252只和72只，体重160～200 g，由广西医科大学动物中心提供，合格证号：SCXK（桂）2014-0002。

1.1.2 药材 方中所需石膏、知母、生地、麦冬、白芍、甘草，均购自广西中医药大学第一附属医院药学部，由广西中医药大学赛恩斯新医药学院苑敏教授鉴定，经鉴定分别为盐酸盐类矿物硬石膏族石膏（Gypsum Fibrosum）、百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根茎、百合科植物麦冬[ Ophiopogon japonicus （Linn. f.） Ker-Gawl.]的干燥块根、玄参科植物地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）的干燥块根、毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根，药材性状均符合2010年版《中国药典》一部规定[8]。

1.1.3 试剂 链脲佐菌素（Sigma S0130，批号18883-66-4）；胆固醇（郑州利伟生物实业有限公司，批号130612）；丙硫氧嘧啶片（南通精华制药有限公司，批号131202）；血糖检测试剂盒（四川省迈克科技有限责任公司，批号0507031）；胰岛素（Ins）放射免疫分析试剂盒（天津协和医药科技有限公司，批号 130508）；胰高血糖素（GC）放射免疫分析试剂盒（天津协和医药科技有限公司，批号130508）；三酰甘油检测试剂盒（四川省迈克科技有限责任公司，批号1307021）；总胆固醇检测试剂盒（四川省迈克科技有限责任公司，批号1307031）；高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，批号2013015）；低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，批号2013007）；其他试剂为国产分析纯。

1.1.4 仪器 TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；SN-695B型智能放免γ测量仪（上海原子核研究所日环仪器一厂）；TLXJ-IIB配套放免专用冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试验方法

1.2.1 正交试验 设计结合前期实验结果及相关研究文献，同时查阅2010版《中国药典》一部，得叶氏消渴方各味药材成人常用量[8-10]：石膏15～60 g、知母6～12 g、生地12～30 g、麦冬6～12 g、白芍6～15 g、甘草2～10 g。本研究以此剂量为基础，拟定3个剂量水平，同时将叶氏消渴方6味药：石膏（A），知母（B），生地（C），麦冬（D），白芍（E），甘草（F）作为考察因素，选用正交试验表L18（37）安排试验。各因素水平见表1。

1.2.2 高脂饲料的配制 配方：猪油5%，胆固醇1%，丙硫氧嘧啶0.1%，基础饲料93.9%。

1.2.3 链脲佐菌素致糖尿病模型的复制及分组[11-14] 取健康雄性SD大鼠252只，适应性普通饲料喂养3 d后，随机抽取12只为空白组动物，继续以普通饲料喂养。其余动物给予高脂饲料喂养3周，第22天禁食不禁水24 h，次日上午以35 mg/kg链脲佐菌素（STZ）腹腔注射。72 h后，测FBG，以FBG≥11.1 mmol/L，并伴有多食、多尿、多饮为成模型大鼠；模型组大鼠稳定1周后再次测定FBG，2次血糖均合格者纳入实验。

1.2.4 分组和给药 采用L18（37）正交表将造模成功大鼠根据血糖和体重按随机区组法分为18组，加上模型组、二甲双胍组和空白组共21组，每组12只。给药期间，空白组给予普通饲料及生理盐水，其余各组给予高脂饲料及相应配伍剂量，连续灌胃给药14 d。选择正交试验中的最佳配伍组进行验证实验，雄性SD大鼠72只，随机分为最佳配伍高、中、低剂量组，模型组，二甲双胍组和空白组6个组，每组12只，造模和给药方法同上。

1.2.5 给药剂量 造模同日给药，按成人日服复方生药量60 g（成人按60 kg体重）计算，根据体表面积换算大鼠的等效剂量为成人的6.3倍。灌胃药物浓度为1 mL溶液含复方生药量1 g，各组给药剂量均相当于复方生药量6.3 g/kg；二甲双胍组给予二甲双胍药物200 mg/kg；模型、空白组给予等容积生理盐水，连续灌胃给药14 d；验证实验中，最佳配伍高、中、低剂量组剂量分别为18.6、6.3、3.15 g/kg。

1.2.6 检测指标 末次给药后以水合氯醛腹腔注射麻醉，从大鼠股静脉取血，于室温放置6 h，3500 r/min离心15 min，取血清分别测定血糖（FBG）、血清胰岛素（Ins）、胰高血糖素（GC）、血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-c）、低密度脂蛋白（LDL-c），采用多指标综合评分法进行数据分析。

1.3 数据分析

1.3.1 综合指标的计算及评分 由于在多指标试验中， 有的指标要求越小越好， 有的指标要求越大越好，还有的指标则要求稳定在某一理想值。另外还存在数量级和量纲不同的问题，为了统一各指标的趋势要求，消除各指标间的不可公度性[15-18]。因此，我们设计了一个综合指标（overall desirability，OD），将各个指标统一综合考察，以综合指标进行直观分析和方差分析。在计算综合指标之前，需先将各指标进行规格化，具体方法如下：

1.3.2 统计学方法 使用统计学软件SPSS 17.0进行统计学分析，在正交试验中对综合指标评分进行极差分析和方差分析；验证试验中，组间比较采用t检验，数据结果以均数±标准差表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正交试验结果

根据各项糖脂代谢指标结果， 对各组疗效通过公式计算进行综合评分，见表2～3。综合评分数据的极差大小显示各因素作用主次为C（生地）>B（知母）>A（石膏）>D（麦冬）>E（白芍）>F（甘草），见表3；方差分析结果表明，因素C（生地）、B（知母）对疗效的影响比较差异有统计学意义（P < 0.01），因素A（石膏）对疗效的影响比较差异有统计学意义（P < 0.05），见表4。综合直观分析与方差分析的结果确定叶氏消渴方最佳配伍药量为C3B2A3D3E2F1，即生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麦冬6 g、白芍9 g、甘草6 g。

2.2 最佳组方配伍验证

从实验结果来看，模型组与空白组相比，各项指标比较差异有统计学意义（P < 0.05）；叶氏消渴方最佳配伍各剂量组均能显著降低模型大鼠FBG（P < 0.05）；与模型组相比，高、中剂量组的Ins显著升高（P < 0.05），中剂量组GC显著降低（P < 0.05）；高、中剂量组TG显著降低（P < 0.05）；各剂量组均能显著降低TC、LDL-c（P < 0.05）。结果见表4。

3 讨论

叶氏消渴方为《临证指南医案》治疗消渴病的首方，原文“计，四十，能食善饥，渴饮，日加瘪瘦。心境愁郁，内火自燃。乃消证大病。生地、知母、石膏、麦冬、生甘草、生白芍。”方中以甘寒质润，具有清热凉血，养阴生津的生地替代原方熟地，并作为君药，配合知母、石膏滋阴泻火为臣药，以麦冬、生甘草补液、清热解毒为辅佐，使药生白芍能敛阴、引散血中郁热。从该方巧妙的药物配伍分析，应是《景岳全书》“玉女煎”的化裁活用[19]，是叶天士“范于法而不囿于法”的典型方剂，叶氏善于从营血的角度辨治中上焦消渴病，在阳明热盛，耗液伤津的病机中重视郁火伤阴，体现了其学术过人之处。现代中药药理也验证了该方大多数药物具有多靶点、多环节降血糖的作用[20-26]。

在正交试验中以不同的指标测定结果作为考察指标，虽然结果更为科学客观，但优选出的组方配伍有时并不一致[15]。中药作用有“多靶点、多方位”的原则，其往往是通过调节机体的多个方面而达到治疗效果。针对这一点，本研究运用多指标评价法对实验结果进行了综合分析[17-18]，对各指标数据进行必要的规格化处理。我们通过直观分析与方差分析的结果确定，叶氏消渴方最佳组方配伍为生地30 g、知母9 g、石膏30 g、麦冬6 g、白芍9 g、甘草6 g。综合评分数据的极差大小显示各因素作用主次为生地>知母>石膏>麦冬>白芍>甘草，这为叶氏消渴方生地为君，知母为臣，石膏、白芍、麦冬及甘草为佐使的组方原则提供了实验依据。

在验证实验中，从 FBG的测定结果来看，叶氏消渴方最佳配伍组亦能显著降低 FBG，证明该方对糖尿病大鼠的糖代谢有一定的调节作用，能有效降低血糖；从Ins、GC的测定结果来看，与模型组相比，叶氏消渴方最佳配伍组的血清Ins水平明显升高，GC明显降低，提示其降糖机制可能与修复胰岛β细胞，刺激胰岛素分泌的功能和减低胰高血糖素的作用有关；TG、TC、HDL-c、LDL-c的测定结果显示，叶氏消渴方最佳配伍组可明显降低糖尿病大鼠体内TG、TC、LDL-c水平，提示叶氏消渴方可能通过降低血脂水平改善胰岛素抵抗。

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（收稿日期：2016-07-10 本文编辑：赵鲁枫）