西藏青稞酒曲中真菌的分离与鉴定

郭小芳 王燕鸽 刘 帅 罗开放 张 柯

(西藏大学理学院 西藏拉萨 850000)

西藏青稞酒曲中真菌的分离与鉴定

郭小芳 王燕鸽 刘 帅 罗开放 张 柯

(西藏大学理学院 西藏拉萨 850000)

酒曲微生物对酒的产出率和品质有极大影响。研究西藏青稞酒酒曲中微生物的多样性对于高品质青稞酒的开发具有重要意义。取自西藏6个地区的9份民间青稞酒酒曲中分离、纯化得到67株霉菌；观察固体培养特征和显微特征，将这些菌株分为4个属，7个种，分别为总状毛霉(Mucor racemosus)、鲁氏毛霉(Mucor rouxii)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、常现青霉(Penicillium frequentans)、灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)及粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)。

西藏青稞酒；酒曲；真菌；鉴定；分离

我国用曲酿酒已有几千年的历史，酒曲是中国酒酿造的糖化、发酵和生香剂,含有多种微生物及其产生的酶,其质量对酒的产出率和品质有极大的影响。其中，酒曲微生物是制酒原动力，酒曲的质量离不开其微生物菌群功能的发挥。因此，研究酒曲微生物的性能对揭示我国酒的酿造规律有着十分重要的意义。

随着科学技术与酿酒工业的发展，20世纪90年代以后，我国酒曲微生物的研究迅速兴起,并极大地推动了制曲酿酒的迅猛发展。罗文等[1]从4种酒曲中分离得到7株糖化菌和4株酵母菌。张东亮等[2]筛选出具有较高糖化和酯化能力的曲霉菌。于博等[3]对广东肇庆传统小曲的优势霉菌进行了分离,得到糖化酶活力强的一株米根霉。喻凤香等[4]从酒曲中分离到30株根霉菌。马蕤等[5]从湖北民间传统酒曲中分离到1株产糖化酶活力强的米根霉。王世强等[6]对苏州酒曲与徽州酒曲中的酵母菌和霉菌菌落及个体形态、生长状况、淀粉酶活力及酒化力等方面进行了比较。Wang等[7]对茅台酒曲中200多个菌落进行定性分析,显示存在细菌、霉菌和酵母菌，其中霉菌由曲霉属、白霉属、根霉属、红曲霉和木霉属组成。刘洪伟等[8]从贵州茅台酒酒曲分离出5株真菌，分别鉴定为米曲霉、红色红曲菌、黑曲霉、炭黑曲霉和米根霉。李健容等[9]从选取的民间传统酒曲中分离得到酵母菌和根霉菌，其中根霉菌分别为米根霉和华根霉。

青稞，又称为裸大麦、元麦或裸麦，是藏区主要农作物，主要用于生产糌粑和青稞酒。青稞酒是一种酿制历史悠久、极富民族特色的低度发酵酒，该酒酒味酸甜，酒香浓郁，是藏族人民日常生活不可或缺的饮品之一。由于地域等限制，对于青稞酒曲微生物的研究并不如内地工业生产酒曲及传统酒曲那般兴盛，仅有一些零星报道。杜木英等[10，11]研究了传统青稞酒发酵过程中化学成分的动态变化规律，并比较了青稞酒多菌种曲发酵与传统曲发酵过程中化学成分的动态变化规律等。青稞酒在西藏酿制十分广泛，各地区由于交通、环境条件等差异导致青稞酒曲中微生物种类和数量存在差异，因此本实验在以往工作的基础上[12]以源自西藏六个地区的青稞酒酒曲为研究对象，分离并鉴定了青稞酒酒曲中主要霉菌，并比较了九份样品中霉菌的种类和数量，期望为西藏传统青稞酒真菌物种多样性提供理论依据，并为青稞酒发酵菌种配方的优化奠定基础。

1 材料

1.1 酒曲

九份酒曲分别采自拉萨市曲水县、那曲地区索县、山南地区曲松县、林芝地区察隅县、林芝地区林芝县、昌都地区昌都县、昌都地区江达县、日喀则地区谢通门县、日喀则地区仁布县。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基、察氏培养基和改良马丁氏培养基。

2 研究内容与方法

2.1 酒曲中真菌的分离与纯化

分离：取9份样品各1.0g，用研钵研成粉末，分别均匀撒在马铃薯葡萄糖、察氏及改良马丁氏培养基上，每个处理三个重复，置于25℃下培养5～7d。

纯化：用平板划线法进行酒曲中真菌的纯化，培养基采用改良马丁氏培养基。

2.2 酒曲中霉菌的鉴定

菌落形态观察和记录：选取无污染、生长良好的纯化菌株的平板，观察并记录菌落形态（菌落表面、菌落正反面颜色、中心及边缘颜色等）。

显微特征观察：在光学显微镜下进行镜检（放大倍数一般为640倍）。

鉴定：结合真菌的固体培养特征及显微观察特征，参照《真菌鉴定手册》、《常见和常用真菌》，初步鉴定真菌的种类。

3 结果分析

3.1 西藏不同地区青稞酒酒曲中真菌固体培养特征

从西藏九份青稞酒曲中共分离到67个真菌菌株。从表1可以看出，分离到的真菌在改良马丁氏培养基上的菌落特征基本包括九类；Lhqp、Lhqm2、Nsp1、Sqp1、Sqc2、Lcp、Lcc2、Llp、Llc1、Ccp、Ccc1、Cp1、Cc1、Cm2、Rxc3、Rc1等16个菌株菌落特征相同；Lhqc1、Sqc1、Llc2、Ccc2、Rxc1等5个菌株菌落特征相同；Lhqc2、Lhqm4、Nsp2、Nsc3、Sqp2、Sqc4、Sqm2、Llc3、Llm2、Ccc5、Cp2、Cc3、Cm3、Rxp2、Rxc4、Rc3、Rm3等

17个菌株菌落特征相同；Lhqc3、Nsp3等2个菌株菌落特征相同；Lhqm1、Nsc1、Nsm、Sqc3、Sqm1、Lcc1、Lcm、Llm1、Ccc4、Cm1、Rxc2、Rc2等12个菌株菌落特征相同；Lhqm3、Ccm、Cc2、Rxm、Rm1等5个菌株菌落特征相同；Nsc2、Lcc3、Ccc3、Rxp1、Rp1、Rm2等6个菌株菌落特征相同；Sqm3、Lcc4、Cc4等3个菌株菌落特征相同。

表1 西藏不同地区青稞酒酒曲真菌固体培养特征

表2 西藏不同地区青稞酒酒曲真菌显微特征

3.2 西藏不同地区青稞酒酒曲中真菌显微特征（见表2）

为鉴定青稞酒曲中分离的真菌，对分离到的菌株逐一进行了显微观察。如表2所示，酒曲样品中真菌的显微特征大体上可分为七类；Lhqp、Lhqm2、Nsp1、Sqp1、Sqc2、Lcp、Lcc2、Llp、Llc1、Ccp、Ccc1、Cp1、Cc1、Cm2、Rxc3、Rc1等16个菌株显微特征相同；Lhqc1、Lhqm3、Nsc2、Sqc1、Lcc3、Llc2、Ccc2、Ccc3、Ccm、Cc2、Rxp1、Rxc1、Rxm、Rp1、Rm1、Rm2等16个菌株的显微特征相同；Lhqc2、Lhqm5、Nsp2、Nsc3、Sqp2、Sqc4、Sqm2、Llc3、Llm2、Ccc5、Cp2、Cc3、Cm3、Rxp2、Rxc4、Rc3、Rm3等17个菌株显微特征相同；Lhqc3、Nsp3显微特征相同；Lhqm1、Nsc1、Nsm、Sqc3、Sqm1、Lcc1、Lcm、Llm1、Ccc4、Cm1、Rxc2、Rc2等12个菌株显微特征相同；Sqm3、Lcc4、Cc4等3个菌株显微特征相同。

3.3 西藏不同地区青稞酒酒曲中霉菌的鉴定结果（见表3）

通过分析并比较真菌的菌落特征与显微特征，参照《真菌鉴定手册》以及《常见和常用真菌》等资料书，对青稞酒酒曲真菌进行了鉴定，初步鉴定结果如表3所示。从表3可以看出，西藏不同地区酒曲中共分离得到七种真菌，包括：总状毛霉、鲁氏毛霉、爪哇毛霉、常现青霉、产黄青霉、粗糙脉胞菌以及米根霉。

表3 西藏不同地区青稞酒酒曲中真菌的鉴定结果

3.4 西藏不同地区青稞酒酒曲中真菌种类及数量比较（见表4）

表4 西藏不同地区青稞酒酒曲中真菌种类及数量

表4显示，总状毛霉、鲁氏毛霉及爪哇毛霉在各地区酒曲样品中均能分离得到，各个地区这三种毛霉菌数量存在一定差异；常现青霉除林芝地区察隅县酒曲中未分离到外，其他八个地区酒曲中均能分离到，且山南地区曲松县与昌都地区江达县的酒曲中分离到常现青霉的数量略高于其他五个地区；产黄青霉仅在拉萨曲水县与那曲索县酒曲中分离得到，且数量比较少；粗糙脉孢菌仅在山南曲松县、林芝地区察隅县及昌都地区江达县酒曲中分离得到，数量相对较少；米根霉仅在日喀则仁布县酒曲中分离得到。

比较几个地区青稞酒曲真菌种类，可以看出，九份样品中真菌种类多少差别不大，基本有四种或五种。

4 讨论

从西藏青稞酒酒曲中分离到的霉菌主要包括米根霉、总状毛霉、鲁氏毛霉以及爪哇毛霉，这些与内地酒曲中分离到的霉菌种类相一致。本研究还分离到两株青霉菌，青霉菌不属于酒曲中主要的糖化菌，但是有学者报道在酒曲中有青霉菌的存在。如，马青山等[13]通过对云南澜沧江集团中温大曲曲衣和曲心中微生物进行分离与初步鉴定，发现大曲中霉菌以青霉属和毛霉目为主；姚万春等[14]系统地研究了泸州老窖国窖曲不同层次间微生物数量、种类和优势种群差异及规律，发现，国窖曲曲外层以霉菌、酵母菌为主，其中霉菌中含有青霉菌。在个别样品中还分离出了粗糙脉孢菌，此菌未在酒曲微生物相关报道中提及。

目前，人们对酒曲微生物的研究主要在集中分离、纯化、鉴定和保藏，酒曲微生物主要菌群的交替演绎规律的研究以及理化分析及优质功能菌的选育和应用等方面。从研究手段上来看，基本上还处于传统微生物研究阶段，借助于分子生物手段等先进方法的相对较少，青稞酒的研究也是如此。今后应着力采用分子生物学与传统鉴定方法相结合的手段，以便全面了解西藏青稞酒酒曲生物多样性。

[1]罗文,张永华,王启军.生料酿酒用微生物的分离与筛选[J].中国酿造,2006(3):20-23.

[2]张东亮,王启军,林萍,等.生料酿酒用高糖化及酯化能力红曲霉菌株的选择[J].食品工业科技,2007,28(10):111-112.

[3]于博,董开发,张凤英.广东肇庆传统酒曲优势霉菌的分离及鉴定[J].中国食品学报,2007,7(1):95-99.

[4]喻凤香,陈煦,林亲录,等.酒曲根霉的分离纯化及淀粉酶活力测定[J].酿酒,2006,33(3):39-41.

[5]马蕤,朱江,张凤英,等.湖北传统酒曲中优势霉菌F14的鉴定[J].酿酒科技,2007(9):17-19.

[6]王世强，郑扬云.2种地方酒曲主要微生物特性的比较研究[J].中国酿造,2010(3):141-142.

[7]Wang CL,Shi DJ,Gong GL.Microorganisms in Daqu:a starter culture of Chinese Maotai-flavor liquor[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,24(10):2183-2190.

[8]刘洪伟,邬应龙.茅台酒酒曲中5株真菌的分离、纯化、鉴定初报[J].发酵科技通讯,2011(4):26-27.

[9]李健容,蔡爱群.民间传统酒曲主要微生物的分离及鉴定[J].酿酒科技,2007(5):111-121.

[10]杜木英,伍怡郦,阚建全,等.传统青稞酒发酵过程中化学成分动态变化的研究[J].食品工业科技,2007(9):94-97.

[11]曹妍,杜木英,阚建全,等.多菌种发酵青稞酒化学成分变化研究[J].食品科学,2012(11):252-256.

[12]德吉,郭小芳,曲吉,等.酒曲微生物成分对青稞酒品质的影响研究[J].西藏科技,2008(6):23-25.

[13]张青山，马淼，吴永安,等.云南澜沧江中温大曲中微生物初步分析[J].中国酿造,2010（3）：84-85.

[14]姚万春，唐玉明，任道群，等.泸州老窖国窖曲曲坯层次间微生物差异研究［J］.酿酒，2005，32（5）：35-36.

Isolation and Identification of Fungus from the Tibetan Highland Barley Wine Yeast

Guo Xiao-fang Wang Yan-ge Liu-Shuai Luo Kai-fang Zhang-Ke
(School of Science,Tibet University,Lhasa 850000,Tibet)

Microbes in distiller's yeast have a great effect on the yield and quality of liquor.Research on the microbial diversity in the Tibetan highland barley wine yeast is great important for development of high-quality barley wine.67 strains of fungus were isolated from nine samples of highland barely wine yeasts collected from six regions in Tibet.Based on the cultured and microscopic characteristics,these strains can be identified 7 species such as Mucor racemosus,Mucor rouxii,Mucor javanicus,Rhizopus oryzae,Penicillium frequentans,Penicillium griseofulvum and Neurospora crassa.

Tibetan highland barely wine;Wine Yeast;fungus;identification;isolation

S512.3

A

1005-5738(2014)02-037-07

[责任编辑：蔡秀清]

2014-06-11

2013年度西藏自治区大学生创新性实验训练计划项目“西藏青稞酒曲微生物多样性及发酵菌种配方优化研究”阶段性成果，项目号：2013CX013

郭小芳，女，汉族，甘肃兰州人，西藏大学理学院副教授，主要研究方向为微生物学及植物生态学。