顶空固相微萃取结合全二维气相色谱-飞行时间质谱技术解析典型青稞酒中挥发性组分特征

张有香，鲁水龙，叶晖春，赵国华，孙海浪，冯声宝

（青海互助天佑德青稞酒股份有限公司，青海互助 810599）

白酒作为一种蒸馏酒，主要成分为酒精和水，约占总量的98 %，决定白酒风格特征的微量组分仅占2 %，但这2 %的风味组分中却包含了成百上千种挥发性物质[1]。目前在中国白酒、葡萄酒、啤酒及日本清酒挥发性组分研究中均分离鉴定出近1000种挥发性组分，已报道的青稞酒中挥发性化合物种类为112种[2]，远低于其他酒中的研究结果，与青稞酒复杂酿造工艺特征不相符。为了进一步认识青稞酒挥发性组分及香气特征，明晰青稞酒独特风味特征形成的物质基础，对青稞酒挥发性组分特征的研究手段和技术亟待提高。不仅能够更全面的解析青稞酒的活性成分,而且通过更深入的解析青稞酒的风格特征,为青稞酒的品质提升、功能价值挖掘、品类打造奠定重要的基础。

由于白酒中挥发性组分组成的复杂性，目前主要的研究手段是采用传统气相色谱(GC)技术对复杂组分进行分离后结合质谱(MS)等检测技术进行定性、定量分析。传统一维色谱技术由于峰容量有限，一次仅能分离约100 种挥发性组分，无法满足白酒中上千种物质的一次性分离分析。全二维气相色谱技术(GC×GC)是近年开发出的一种多维色谱分离技术[3]，该技术将两种分离机理不同的毛细管色谱柱通过一个调制器实现串联结合形成二维气相色谱系统对样品进行分析。分析样品通过第一维色谱柱分离后连续转移至第二维色谱柱中进行再次分离。与常规一维气相色谱比较，具有分辨率高,灵敏度高,峰容量大等优点。与高灵敏度的飞行时间质谱(TOFMS)联合使用,是实现复杂样品挥发性组分分离鉴定的有力工具。目前GC×GCTOFMS 技术已经被用于多种酒精饮料挥发性组分的分析，是当前分析酒精饮料中挥发性组分最高效的技术手段。本研究采用HS-SPME-GC×GCTOFMS 分析技术用于典型青稞酒中微量特征成分分析，首次对青稞酒中挥发性组分构成进行了全面解析。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：本实验采用的青稞酒样品为黑老鸦品种秋酿一米查纯大曲工艺青稞原酒、瓦蓝品种秋酿一米查纯大曲工艺青稞原酒、脱皮青稞秋酿一米查纯大曲工艺原酒、有机青稞秋酿一米查纯大曲工艺原酒，均取自公司原酒库，存储时间为5年。

试剂：纯氯化钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；超纯水由纯水仪(Millipore,Badford,MA,USA)制备。

仪器设备：2 cm 50/30 μm 固相微萃取三相头（divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)，上海Sigma-Aldrich 贸易有限公司；全二维气相色谱-飞行时间质谱仪(GC×GCTOFMS，Pegasus 4D，Leco Corporation,USA)系统，GC×GC 系统由安捷伦7890N 气相色谱和冷喷调制器KT-2001 组成，本实验采用液氮冷喷调制器；质谱检测器为美国LECO Pegasus 4D 飞行时间质谱。

1.2 实验方法

1.2.1 顶空固相微萃取(HS-SPME)实验方法

参照文献[5]的方法进行。HS-SPME 萃取及进样过程为手动进行，萃取头为2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 三相萃取头。萃取温度50 ℃，样品平衡时间15 min，萃取时间50 min，恒温磁力搅拌器转速400 r/min。

1.2.2 样品前处理流程

取2 mL 白酒样品,8 mL 超纯水及3.0 g 氯化钠于20 mL 顶空瓶混合均匀后密封，在50 ℃温度下样品平衡15 min，萃取50 min，恒温磁力搅拌器转速400 r/min，进行顶空固相微萃取（HS-SPME）操作，完成萃取后萃取头于GC 进样口250 ℃解吸附5 min，进行GC×GC-TOFMS分析。

1.2.3 GC×GC-TOFMS分析方法

色谱柱系统：一维色谱柱DB-FFAP(极性柱，60 m×0.25 mm ID,0.25 μm),二维色谱柱Rxi-17(中等级性柱，1.5 m×0.18 mm ID,0.2 μm)。色谱条件：GC 进样口温度250 ℃，进样模式采用不分流模式进行；第一维柱温箱升温程序：起始温度40 ℃保持2 min后，以5 ℃/min 升温至230 ℃，保持5 min，调制器调制时间为4 s，热调制时间为1 s，调制补偿温度为20 ℃；第二维柱温箱升温程序：起始温度60 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升温至250℃保持5 min，样品运行采用恒流模式，载气为高纯氦气(纯度99.9995%),流速为1 mL/min。

1.2.4 质谱条件

EI离子源,电压为70 eV，离子源温度为230 ℃，传输线温度为280 ℃，检测器电压为1365 V，采集质量数范围为35～500 amu，采集频率为100 spectrum/s。数据采集由LECO 公司Pegasus 4D 工作站控制。

1.2.5 GC×GC-TOFMS数据处理

实验采集的TOFMS 数据由LECO 公司Chroma TOF 工作站进行数据处理，自动识别信噪比大于50 的色谱峰进行自动积分解卷积和质谱库比对,质谱库为NIST 14 和Wiley 9，所有比对结果自动生成“峰表”。“峰表”经过进一步人工解谱及同系物二维色谱出峰规律比对验证后作为初步鉴定结果。剔除烷烃类等没有风味贡献的化合物，选择相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000的化合物作为最终鉴定结果[4]。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOFMS 用于典型青稞酒挥发性组分分离特性分析

白酒作为一种组分十分复杂的体系，传统一维气相色谱质谱联用技术由于分离分析能力的局限无法完成白酒复杂样品中挥发性组分的有效分离，需要结合繁琐的样品预处理、预分离手段。全二维气相色谱技术的出现为白酒这种复杂样品的分离提供了新的解决方案[6]。根据全二维气相色谱分离方式，第一维长色谱柱所有组分经过调制器聚焦后进入第二维短色谱柱进行再次分离，再由高通量的飞行时间质谱进行检测。色谱柱的选择上第一维长色谱柱通常采用非极性色谱柱，依靠分离物沸点差异进行分离；第二维短色谱柱通常采用极性柱或中等极性柱，根据化合物的极性差异进行再次分离，最终获得具有结构特征的二维色谱图[7]。基于这一原则，本研究采用一维DB-5MS色谱柱搭配二维Rxi-200 色谱柱对青稞酒中挥发性组分进行分析，获得图1 所示全二维分析谱图。结果显示青稞酒中挥发性组分十分复杂，一维色谱图中有大量化合物存在共流出现象，通过进一步的二维色谱分离，共流的化合物在二维色谱图中得到了较好的分离。

图1 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS全二维分析图谱

2.2 青稞酒中挥发性组分的HS-SPME-GC×GCTOFMS分析鉴定

通过全二维气相色谱分离结合高通量飞行时间质谱检测,在青稞酒中共分离检测到1399 个色谱峰。大量色谱峰的检出，对化合物的鉴定提出了巨大的挑战，传统一维气相色谱质谱峰逐一鉴定方法难以实现。本实验采用以下策略对谱图中的化合物进行鉴定分析：通过力可Pegasus 4D 色谱分析工作站结合mainlib 谱库、replib 谱库、nist 谱库以及wiley谱库的自动解卷积和检索分析(选择S/N＞50的色谱峰进行分析)，选择相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的化合物作为鉴定结果。本研究在典型青稞酒中共鉴定出挥发性组分1399种(表1)。

表1 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的化合物统计(种)

2.2.1 酯类化合物

酯类物质是白酒中种类最丰富的一类挥发性风味组分，本研究鉴定出青稞酒中挥发性酯类物质290种，酯类物质通常具有甜香、花香、果香等香气特征，表2 列出了重要的70 种酯类物质，包括甲酯类10种，乙酯类35种，丙酯类10种，丁酯类15种，其他酯类7种，乙酯类化合物是青稞酒酯类物质中最重要的一类。

表2 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的重要酯类化合物

2.2.2 醇类化合物

通过力可Pegasus 4D 色谱分析工作站结合mainlib谱库、replib谱库、nist谱库以及wiley谱库的自动解卷积和检索分析，选择相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的醇类化合物，初步鉴定出醇类化合物214种，表3 列出了重要的47种，其中饱和醇24种，不饱和醇17种，其他醇6种，饱和醇类是酒精饮料风味构成的骨架成分之一。

表3 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的重要醇类化合物

2.2.3 酸类化合物

通过力可Pegasus 4D 色谱分析工作站结合mainlib谱库、replib谱库、nist谱库以及wiley谱库的自动解卷积和检索分析，选择相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的酸类化合物，初步鉴定出酸类化合物40种，表4 列出了重要的22种，其中饱和脂肪酸8种，其他酸14种。

表4 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的重要酸类化合物

2.2.4 萜烯类化合物

通过力可Pegasus 4D 色谱分析工作站结合mainlib谱库、replib谱库、nist谱库以及wiley谱库的自动解卷积和检索分析(选择S/N＞50 的色谱峰进行分析)，选择相似度大于600，反相似度大于600，可能性大于2000 的萜烯类化合物进一步结合人工解谱验证、二维色谱出峰规律比对验证和文献RI的比对验证，初步鉴定出的萜烯类化合物为91种。表5 列出了重要的萜烯类化合物。对比徐岩等[19]研究中检测出的萜烯化合物，本研究多出25种。根据文献报道，本研究检测出的萜烯类化合物具有愉悦的花香且香气阈值较低，对青稞酒香气特征复杂性具有重大的贡献，其中大部分萜烯类化合物在青稞酒中是首次发现[8-9]，有待后期进一步的研究和分析。

表5 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析鉴定的萜烯类化合物

萜烯类化合物既是构成白酒香气特征的一类重要香气化合物，也是白酒中重要的一类生理活性物质。Bata-大马酮（具有花香、蜜香特征）是清香型白酒中重要香气化合物，里哪醇、橙花叔醇、β-紫罗酮氧化物都具有愉悦的花香特征，是酒精饮料中的重要香气化合物[10]。除了香气贡献外，萜烯类化合物还有重要的生理功能[11]。α-蒎烯、L-柠檬烯、葑醇等具有抗菌活性，可以抑制多种微生物的生长，如细菌、霉菌；4-萜品醇、龙脑、里哪醇等具有抗病毒活性；薄荷醇具有镇痛活性；蒎烯类（含桧烯、左旋-α-蒎烯、龙脑）能显著增加胆汁分泌[12]。青稞酒中检测出的功能性萜烯类化合物可能对青稞酒的健康价值具有贡献，但这些物质的含量和功能还需要进一步深入细致的研究。

2.2.5 含氮类化合物

通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鉴定出青稞酒中含氮化合物超过111种，包括吡嗪、吡啶、哒嗪、吡唑等，表6 列出了青稞酒中鉴定出的20种重要含氮类化合物，其中有十几种化合物是首次发现。含氮类化合物一般呈现坚果香、烤面包香及可可的香味，是白酒中重要的一类香气物质[13-14]。首次发现的含氮类化合物对青稞酒香气特征和生理功能的贡献还需要进一步的研究。

表6 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的重要含氮类化合物

2.2.6 含硫化合物

通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鉴定出青稞酒中含硫化合物超过48种，表7 列出了青稞酒中鉴定出的13 种重要含硫化合物。硫化物的香气特殊且香气阈值较低，对酒的香气特征具有重要贡献[15]。挥发性含硫化合物对青稞酒风味贡献的认知目前还是空白的，文献报道3,4-二甲基噻吩、2-甲基噻吩具有煮肉的香气特征[16]，以上化合物对于构成青稞酒香气的复杂性贡献值得进一步深入的研究。

表7 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析鉴定的重要含硫类化合物

2.2.7 酚类化合物

通过HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析共鉴定出青稞酒中酚类化合物超过68种，表8 列出了青稞酒中鉴定出的重要酚类化合物[17]，比徐岩等[19]对酚类化合物的研究多了18种。

表8 青稞酒HS-SPME-GC×GC-TOFMS 分析鉴定的酚类化合物

2.3 4种不同品种青稞酒之间的比较分析

4 种青稞酒同一米查次同种工艺同一季节挥发性组分之间的比对分析。

本研究采用的样品为4 种不同品种的青稞酒，分别为黑老鸦青稞秋酿一米查纯大曲工艺、瓦蓝青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺、脱皮青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺、有机青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺，采用GC×GC-TOFMS 分析方法，从醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚类9 个层面比较不同品种青稞酒挥发性组分之间的差异[18]，见表9。

表9 4种青稞酒重要挥发性组分种类统计表(种)

2.3.1 酯类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有210 种、196 种、191种、220种，从图2 可以看出其中103 种是4 种青稞酒所共有的，黑老鸦青稞酒独有的有49种，瓦蓝青稞酒独有的有22种，脱皮青稞酒独有的有23种，有机青稞酒独有的有28种。

图2 4种不同原料青稞酒酯类化合物对比图

2.3.2 醇类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有119 种、121 种、134种、134种，从图3 可以看出，其中50 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有32种，瓦蓝青稞酒独有的有29种，脱皮青稞酒独有的有32种，有机青稞酒独有的有38种。

图3 4种不同原料青稞酒醇类化合物对比图

2.3.3 酸类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有31种、28种、25 种、36种，从图4 可以看出其中7 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有12种，瓦蓝青稞酒独有的有6种，脱皮青稞酒独有的有8种，有机青稞酒独有的有14种。

图4 4种不同原料青稞酒酸类化合物对比图

2.3.4 醛酮类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有135 种、156 种、145种、152种，从图5 可以看出其中43 种是4 个品种所 共有，黑老鸦青稞酒独有的有43种，瓦蓝青稞酒独有的有41种，脱皮青稞酒独有的有32种，有机青稞酒独有的有36种。

图5 4种不同原料青稞酒醛酮类化合物对比图

2.3.5 呋喃类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有63种、53种、62种、48种，从图6 可以看出其中19 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有18种，瓦蓝青稞酒独有的有11种，脱皮青稞酒独有的有14种，有机青稞酒独有的有4种。

图6 4种不同原料青稞酒呋喃类化合物对比图

2.3.6 含硫化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有31种、17种、20 种、18种，从图7 可以看出其中4 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有15种，瓦蓝青稞酒独有的有5种，脱皮青稞酒独有的有4种，有机青稞酒独有的有2种。

图7 4种不同原料青稞酒含硫化合物对比图

2.3.7 含氮化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有24 种、24 种、23 种、18种，从图8 可以看出其中6 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有7种，瓦蓝青稞酒独有的有7种，脱皮青稞酒独有的有5种，有机青稞酒独有的有6种。

图8 4种不同原料青稞酒含氮化合物对比图

2.3.8 萜烯化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有37种、45 种、38 种、31种，从图9 可以看出其中9 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有11种，瓦蓝青稞酒独有的有15种，脱皮青稞酒独有的有8种，有机青稞酒独有的有4种。

图9 4种不同原料青稞酒萜烯化合物对比图

2.3.9 酚类化合物

从总量上而言，黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、脱皮青稞酒、有机青稞酒分别含有23种、21种、19种、24种，从图10 可以看出其中9 种是4 个品种所共有，黑老鸦青稞酒独有的有10种，瓦蓝青稞酒独有的有2种，脱皮青稞酒独有的有2种，有机青稞酒独有的有5种。

图10 4种不同原料青稞酒酚类化合物对比图

2.3.10 不同原料青稞酒特有化合物统计

本研究采用的样品分别为黑老鸦青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺、瓦蓝青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺、脱皮青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺、有机青稞酒秋酿一米查纯大曲工艺，采用GC×GC-TOFMS 分析方法，从醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚类9 个层面比较不同品种青稞酒挥发性组分之间的差异。表10 列出了4 种不同原料青稞酒所特有的化合物种类数量，依次排序为黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、有机青稞酒、脱皮青稞酒。从表10 中可以看出，黑老鸦青稞酒中除了酸类化合物和萜烯类化合物，其他均高于另外3 种青稞酒，其中特有的含硫化合物可能是形成黑老鸦青稞酒独特风味的原因之一，黑老鸦青稞酒中含硫化合物的香气特征有待进一步研究。瓦蓝青稞酒中萜烯类化合物的含量均高于其他3 种青稞酒，有可能是形成瓦蓝青稞酒独特风味的原因之一。

表10 4种不同原料青稞酒特有化合物统计表(种)

3 结论

3.1 学习了全二维气相色谱飞行时间质谱仪原理(GC×GC-TOFMS)，了解了二维和一维之间的不同及二维的优点，白酒作为一种组分十分复杂的体系，传统一维气相色谱质谱联用技术由于分离分析能力的局限无法完成白酒复杂样品中挥发性组分的有效分离，往往需要结合繁琐的样品预处理、预分离手段。全二维气相色谱技术的出现为白酒这种复杂样品的分离提供了新的解决方案。根据全二维气相色谱分离方式，第一维长色谱柱所有组分经过调制器聚焦后进入第二维短色谱柱进行再次分离，再由高通量的飞行时间质谱进行检测。色谱柱的选择上第一维长色谱柱通常采用非极性色谱柱，依靠分离物沸点差异进行分离，第二维短色谱柱通常采用极性柱或中等极性柱，根据化合物的极性差异进行再次分离，最终获得具有结构特征的二维色谱图。基于这一原则，本研究采用一维DBFFAP色谱柱搭配二维Rxi-17色谱柱对青稞酒中挥发性组分进行分析，结果显示青稞酒中挥发性组分十分复杂，一维色谱图中有大量化合物存在共流出现象。通过进一步的二维色谱分离，共流出的化合物在二维色谱图中得到了较好的分离。

3.2 首次采用全二维气相色谱飞行时间质谱(GC×GC-TOFMS)技术对青稞酒挥发性组分特征进行了定性分析，建立了适合于青稞酒挥发性组分分析的GC×GC-TOFMS 方法。将我公司青稞酒挥发性组分的分析能力从百种化合物水平提升至千种化合物水平，初步鉴定出典型青稞酒中挥发性组分1399种，其中酸类物质40 种、酯类290 种、醇类214 种、醛酮类261 种、呋喃及内酯类102 种、硫化物48 种、含氮化合物111 种、酚类68 种、萜烯91 种、其他类129种、未知45种。

3.3 本研究除了检测出常规的醇、酸、酯等挥发性组分外，还检测到组分复杂的挥发性含氮、含硫、萜烯类化合物。本研究检测出的重要含氮化合物有24种，比2014 年解成玉等人对含氮化合物的研究多了22种，这些化合物可能对青稞酒风味具有重要贡献，同时含硫化合物多了30种，可能对青稞酒香气特征具有重要贡献，萜烯类化合物多了25种，这些化合物不仅有一定的香气贡献，还具有重要的生理活性。结果证明我公司青稞酒挥发性组分的复杂性和多样性并不逊于其他白酒。

3.4 首次采用GC×GC-TOFMS 分析方法，从醇、酸、酯、醛酮、呋喃、含硫、含氮、萜烯、酚类9 个层面比较不同品种青稞酒挥发性组分之间的差异，从特有物质种类总量上排序，依次排序为黑老鸦青稞酒、瓦蓝青稞酒、有机青稞酒、脱皮青稞酒。黑老鸦青稞酒中除了酸类化合物和萜烯类化合物，其他化合物均高于另外3 种青稞酒，特有的含硫化合物可能是形成黑老鸦青稞酒独特风味的原因之一，黑老鸦青稞酒中含硫化合物的香气特征有待进一步研究。瓦蓝青稞酒中萜烯类化合物的含量均高于其他3 种青稞酒，有可能是形成瓦蓝青稞酒独特风味的原因之一。脱皮青稞酒和有机青稞酒中含硫、含氮、萜烯、酚类化合物的含量均低于黑老鸦青稞酒和瓦蓝青稞酒，脱皮青稞酒中特有的化合物种类最少。