辅助生殖技术中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吴金香王正尧谢远志蔡俊峰

1. 福建医科大学附属第二医院检验科（泉州 362000）; 2. 福建医科大学附属第二医院生殖男科

辅助生殖技术中Zn2+抑制精子DNA碎片形成*

吴金香1**王正尧1谢远志2蔡俊峰1

1. 福建医科大学附属第二医院检验科（泉州 362000）; 2. 福建医科大学附属第二医院生殖男科

辅助生育技术（assisted reproductive technology，ART）已成为治疗不孕症患者的主要治疗方法之一，因此保证辅助生殖成功以实现优生优育是非常重要的。ART中精子体外优选处理、冷冻及复苏过程中导致的精子氧化损伤影响着精液常规的各项指标[1]。Zn2+是男性体内精子生长发育过程中不可缺少的微量元素。大量研究表明[2-4]，体内Zn2+具有抗氧化作用，然而ART中Zn2+能否保护精子受氧化刺激的损伤作用，目前尚无研究，本研究在优选后的精子中加入适量的Zn2+，通过比较精子的存活率、活力以及精子DNA碎片检测判断Zn2+能否抑制H2O2的氧化损伤精子DNA作用，旨在判断ART中Zn2+能否抑制精子DNA碎片的形成。

材料和方法

一、材料

10例正常健康男性精液样品，取自本院有生育能力的青年自愿者，年龄25～30（26±2）岁。ZnCL2为瑞士Adamas-beta公司产品。30% H2O2由西陇化工股份有限公司提供。40%上层梯度离心液，80%下层梯度离心液,洗精液均为美国Quinn's公司产品。精子DNA碎片检测试剂盒购于深圳博锐德生物科技有限公司。精子质量分析系统为北京国联医疗技术有限公司产品。 OLYMPUS.CX31型光学显微镜为日本OLYMPUS公司生产。

二、方法

本研究设计不同浓度梯度的H2O2（0.1%，0.01%和0.001%）和Zncl2（50 nmol/L，25 nmol/L，12.5 nmol/L，6.2 nmol/L），应用国联精子检测系统检测精子的存活率和活力来选择最佳的干预浓度为0.001% H2O2和12.5 nmol/L Zncl2。10份正常精液标本，置37℃水浴箱待液化，分别用40%和80%高密度离心液制备梯度液，300×g，15min获取优质精子，Quinn’s洗精液300×g，5min洗涤优质精子2次后将精子密度至5～10×109/L，每份0.3mL平均分为3组：实验组（Zncl2+H2O2）组含12.5 nmol/L Zncl2及0.001%的H2O2；H2O2组含0.001% H2O2；空白组加入等体积0.9%NaCl2。3组同时置37℃、5%CO2孵箱中孵育5h和24h后分析不同实验组之间的差异。

1. 精子活力与存活率的分析：3组同时置37℃，5% CO2孵箱中孵育5h和24h后，用国联精子检测系统观察精子运动功能的变化，从而判断精子的存活率与活力。

2. 精子DNA碎片的检测：本实验采用精子染色质扩散法进行检测：3组实验分别取60μl参照精子DNA检测试剂盒说明书进行操作。DNA完整的精子在经过变性和去掉核蛋白后DNA扩散形成特征性的光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生这种特征性的光晕。根据光晕的有无和大小判断精子DNA的完整程度。精子DNA碎片判断标准：精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1/3，（如图1）。随机选取视野观察（×400倍），计数500个精子，按以下公式计算出存在DNA碎片精子百分率：

图1 精子DNA碎片检测示意图

3. 应用SPSS 20.0软件进行统计分析，多组的均数比较采用随机区组设计的方差分析，组间两两比较采用LSD法，双侧检验，P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

一、Zn2+对受H2O2影响精子活力与存活率的保护作用

10例正常健康男性精液经ART中精液优化处理后在H2O2作用下精子运动能力显著下降，明显低于同时加入适量Zncl2的实验组，差异比较均具统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 Zn2+对H2O2影响优选后精子活力和存活率的保护作用（n=10，±s，%）

表1 Zn2+对H2O2影响优选后精子活力和存活率的保护作用（n=10，±s，%）

5h后 24h后活力 存活率 活力 存活率空白组 84.25 94.2 78.61 92.14 H2O2组 3.43 23.24 0 0实验组 26.14 61.32 0.79 6.35

二、Zn2+对H2O2影响精子损伤DNA的抑制作用

10例正常健康男性精液经ART中精液优化处理后在H2O2刺激下精子DNA完整性严重破坏，DNA损伤程度明显高于同时加入适量Zncl2的实验组，差异比较均具统计学意义（P＜0.001），结果见图2。

图2 3组精子DNA损伤程度比较

讨 论

男性不育占不育症30%，常见的病因有生殖系炎症、精索静脉曲张、无精子症、畸形精子等。精子DNA碎片化是近几年的研究热点，其形成是导致男性不孕的主要原因之一，是精子DNA损伤的一种表现，与精子细胞凋亡密切相关[5,6]。男性精子DNA碎片化的形成造成精子内部遗传信息的不完整，严重影响生育情况，会导致不孕、反复流产和胎儿畸形，造成胎儿发育停滞和辅助生殖失败等[7,8]。因此如何避免精子DNA碎片化的形成是目前的研究热点。目前国内外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能与炎症、凋亡、氧化损伤以及环境因素等多种因素作用相关[5-8]。

ART已成为不孕症患者的主要治疗方法之一，因此保证辅助生殖成功以实现优生优育是非常重要的。ART已经发展30多年，尽管ART可以促进精液液化，通过各种方法去除精液中的白细胞、死精子以及部分畸形精子等，从而达到精子优选的目的，但仍无法去除DNA碎片化的精子，且ART中存在造成精子DNA碎片化的可能因素，比如精子优选方法选择、精子优选过程中离心力和离心时间的选择、优选后精子的培养时间以及精子的冷冻与复苏等[9,10]，因此降低精子优选过程中精子DNA碎片，提高体外辅助受孕率和优生优育率是非常必要的，但目前尚无这方面的研究。

目前国内外多数研究停滞于精子DNA碎片化的检测方法学以及临床意义的研究，其形成的确切机制以及预防措施方面的研究不多。Villani等[6]研究者认为精子DNA碎片化形成是导致精子凋亡的前期表现，而细胞凋亡与DNase和caspases密切相关。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是细胞正常代谢产生的有毒物质，ROS增加影响精子质量以及精子DNA完整性，从而导致不孕、反复流产和胎儿畸形等。ROS及炎症刺激等激活精子细胞内DNase和caspases系统，从而降解精子DNA导致精子DNA损伤引起精子凋亡，因此研究者认为精子DNA碎片化形成与DNase的活化以及caspases系统的激活相关[6,11]。Sibirtsev等[11]应用H2O2和DNase对人、老鼠和公牛3个物种的精子进行处理研究，结果表明3个物种精子DNA碎片损伤与过氧化氢和DNase酶密切相关，而人的精子对DNase酶的敏感性最高。Sibirtsev等[11]研究Ca2+，Mg2+依赖的DNase在中间球海胆（Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius）精子中的活化并激活caspases系统降解精子DNA的机制，并指出Zn2+可以阻断DNase的降解中间球海胆精子DNA的作用，从而减少中间球海胆精子DNA碎片的作用。

Zn2+在睾丸生精过程中具重要的作用，是男性体内精子生长发育过程中不可缺少的微量元素。目前尚无学者研究Zn2+是否在体外ART中的预防和减少精子DNA碎片形成的作用。本研究采用ART中优选的精子为实验对象，以H2O2为氧化刺激物，通过精子DNA碎片的检测结合国联软件系统分析并比较精子的活率、活力，判断Zn2+能否抑制H2O2对精子的氧化损伤作用。实验结果表明，在ART中H2O2可明显损伤精子DNA的作用，适量的Zn2+能明显减少H2O2对人类精子的DNA碎片，从而保护精子DNA的完整性，为ART以及优生优育提供实验依据。另外在本研究中发现体外培养基中Zn2+浓度远低于精浆中的Zn2+浓度，主要是Zn2+在体内不同部位的浓度分布不一，ART中应用的培养基主要是参照输卵管液，可见在输卵管位置Zn2+的量明显少于精浆。

精子; DNA碎片裂; 生殖技术, 辅助

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3 Sankako MK, Garcia PC, Piffer RC,et a1. Possible mechanism by which zinc protects the testicular function of rats exposed to cigarette smoke.Pharmacol Rep2012; 64(6): 1537-1546

4 Kotdawala AP, Kumar S, Salian SR,et a1. Addition of zinc to human ejaculate prior to cryopreservation prevents freeze-thaw-induced DNA damage and preserves sperm function.J Assist Reprod Genet2012; 29(12): 1447-1453

5 Zhang HB, Lu SM, Ma CY,et a1. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation.Asian J Androl2008; 10(2): 227-235

6 Villani P, Eleuteri P, Grollino MG,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Reproduction2010; 140(3): 445-452

7 Dupont C, Faure C, Sermondade N,et a1. Obesity leads to higher risk of sperm DNA damage in infertile patients.Asian J Androl2013; 15(5): 622-625

8 López G, Lafuente R, Checa MA,et a1. Diagnostic value of sperm DNA fragmentation and sperm high-magnif cation for predicting outcome of assisted reproduction treatment.Asian J Androl2013; 15(6): 790-794

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10 Calamera JC, Fernandez PJ, Buffone MG,et al. Effects of long–term in vitro incubation of human spermatozoa: functional parameters and catalase effect.Andrologia2001; 33(2): 79-86

11 Sibirtsev JT, Shastina VV, Menzorova NI,et a1. Sperm DNA fragmentation induced by DNAse I and hydrogen peroxide: an in vitro comparative study among different mammalian species.Mar Biotechnol(NY)2011; 13(3): 536-543

（2014-04-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.012

R 698.2

资助: 福建省卫生厅青年科研基金资助项目（NO.2011-1-36）**

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