前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠前列腺组织TGF-β1、CTGF表达的影响*

朱 勇孙 磊吴云皓杨 凯焦刚亮牛培宁曾庆琪**

1. 南京中医药大学（南京 210046）;

2. 南京中医药大学附属盐城市中医院男科; 3. 江苏建康职业学院

前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠前列腺组织TGF-β1、CTGF表达的影响*

朱 勇1,2孙 磊3吴云皓1杨 凯1焦刚亮1牛培宁1曾庆琪3**

1. 南京中医药大学（南京 210046）;

2. 南京中医药大学附属盐城市中医院男科; 3. 江苏建康职业学院

目的探讨前列腺炎Ⅰ号治疗慢性非细菌性前列腺炎的作用机制。方法将70只雄性大鼠随机分为空白组（生理盐水10ml•kg-1）、模型组（生理盐水10ml•kg-1）、阳性组（前列舒乐颗粒2.4g•kg-1）和前列腺炎Ⅰ号小剂量组（10g•kg-1）、前列腺炎Ⅰ号中剂量组（20g•kg-1）、前列腺炎Ⅰ号大剂量组（40g•kg-1）。采用免疫性造模方法，空白组则注射生理盐水，30d后重复造模一次，45d后灌胃给药。给药28d后，剥取前列腺组织，免疫组化检测转化生长因子-β1（TGF-β1）和结缔组织生长因子（ CTGF）表达水平。结果与空白组相比，其余各组大鼠前列腺组织TGF-β1和CTGF表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，其余各组大鼠前列腺组织TGF-β1、CTGF表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阳性组相比，其余各组大鼠前列腺组织TGF-β1、CTGF表达水平均有明显差异性，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 前列腺炎Ⅰ号各剂量组能有效抑制CNP大鼠前列腺组织TGF-β1和CTGF的表达水平，改善前列腺组织的纤维化程度，其中，中、大剂量组效果更佳。

前列腺炎/药物疗法; 转化生长因子β1

前列腺炎Ⅰ号为曾庆琪教授临床经验方，对慢性前列腺炎尤其是非细菌性前列腺炎（CNP，Chronic Nonbacterial Prostatitis）的治疗疗效显著[1,2]。通过构建非细菌性前列腺炎模型，评判前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠前列腺组织转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）表达的影响，探讨其作用机制，为新药开发提供实验参考。

材料与方法

一、材料

（一）动物

SD雄性大鼠80只，体质量180-220g，由江苏大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(苏)2009-0002。

（二）药品

前列腺炎Ⅰ号（萆薢、石菖蒲、台乌药、益智仁、威灵仙、冬瓜子、白芷、马鞭草、茯苓、皂角刺、菟丝子、五味子、水蛭等）由江苏省中医院制剂部提供；前列舒乐颗粒（主要成分为淫羊藿、黄芪、车前草、蒲黄、川牛膝，4g/袋），贵州关德兴宝芝林药业有限公司生产，批准文号为国药准字Z52020270，产品批号为20130404；弗氏完全佐剂（FCA），由MPBIO（FRANCE）生产，批号：06858；吸附无细胞百白破联合疫苗，长春长生生物科技股份有限公司生产，批准文号为国药准字S20083110，批号为20120302。

（三）试剂

考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号为20130315；TGF-β1兔多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），批号为20130426；CTGF兔多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），批号为20130507；即用型SABC-POD（兔IgG）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），批号为20130621；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），批号为20130208。

（四）仪器

FA1104电子分析天平（上海舜宇平恒科学仪器有限公司）；Synergy HT酶标仪（美国Bio-Tek公司）；GS-15R 低温离心机（美国BECKMAN公司）；TD6001电子天平，天津市天马仪器厂；-80℃超低温冰箱（日本SANYO公司）；LDZ5-2离心机（北京医用离心机厂）；ULTRA-TURRAX匀浆机（德国IKA公司）。

二、方法

（一）分组

将70只SD雄性大鼠随机分为6组，其中空白组10只，模型组12只，阳性组12只，前列腺炎Ⅰ号小剂量组12只，前列腺炎Ⅰ号中剂量组12只，前列腺炎Ⅰ号大剂量组12只。

（二）造模

1. 大鼠前列腺蛋白提纯液制备方法：参考文献[3]，将10只SD雄性大鼠脱颈椎处死，无菌条件下剥取前列腺组织，生理盐水冲洗，加入含0.5%TritonX-100的生理盐水，冰浴匀浆，将匀浆液放于4℃高速低温离心机中10000r/min，离心5min，吸取上清液，比浊法测定其蛋白浓度。临用前，用0.01mmol/L PBS调节至15mg/mL。

2. 造模方法：参考文献[4]，大鼠乙醚麻醉，模型组、阳性组、前列腺Ⅰ号小中大各剂量组均腹腔注射百白破疫苗0.5mL，皮下多点注射前列腺蛋白提纯稀释液（15mg/mL）与FCA混合乳剂（1:1体积）1mL，注射点为双侧腹股沟各0.2mL，双侧大腿内侧各0.1mL，背部0.4mL，空白组用同样方法注射等量生理盐水。30d后，重复一次，第45天每组各处死2只动物，剥取前列腺组织送病理检查，观察前列腺组织结构符合慢性炎症改变可判定造模成功（前期预实验研究显示该造模方法的成功率为100%）。

（三）给药方法

各组均按体质量灌胃给药，根据人-大鼠体表面积换算系数换算，每天阳性组给予前列舒乐颗粒2.4g/ kg（相当于成人临床用量4倍），前列腺Ⅰ号小剂量组给予生药量10g/kg（相当于成人临床用量2倍），前列腺Ⅰ号中剂量组给予生药量20g/kg（相当于成人临床用量4倍），前列腺Ⅰ号大剂量组给予生药量40g/kg（相当于成人临床用量8倍），空白组、模型组给予等量生理盐水。造模45d后开始给药，共28d，末次给药4h后处死所有动物。给药过程中，前列腺炎Ⅰ号中、大剂量组各死亡1只。

（四）观察指标及结果分析

剥取大鼠前列腺组织，免疫组化检测TGF-β1 、CTGF表达水平。免疫组化结果用多功能彩色病理图像分析系统进行处理，由东南大学医学院附属中大医院临床病理科协助分析。应用MataMorph图像分析软件，每张病理切片在40×10高倍镜视野下随机选取5个视野，测量前列腺组织阳性表达区平均积分的光密度值以及面密度值，取其平均值作为所检测指标的表达值。

（五）统计学方法

所有数据采用SPSS 16.0统计软件处理，呈正态分布的连续型变量以（±s）进行统计学描述，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、光镜下观察

免疫组织化学染色显示，阳性表达为胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒。其中，TGF-β1主要分布于前列腺组织的上皮及炎症浸润细胞的胞浆内，而CTGF则主要分布于前列腺组织的间质细胞及炎症浸润细胞的胞浆内。

二、前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠前列腺组织TGF-β1表达的影响

免疫组织化学分析显示，空白组大鼠前列腺组织TGF-β1呈阴性表达，与各组有显著差异（P＜0.01或P＜0.05）；模型组呈强阳性表达，与各组有显著差异（P＜0.01）；与阳性组相比，各组均有差异性（P＜0.01或P＜0.05）。结果显示前列腺炎Ⅰ号各剂量组均能抑制TGF-β1的表达，其中，中、大剂量组效果更佳，见图1、表1。

图1 各组大鼠前列腺组织TGF-β1染色（免疫组织化学 ×200）

表1 大鼠前列腺组织免疫组化（TGF-β1）染色结果分析

三、前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠前列腺组织CTGF表达的影响

免疫组织化学分析显示，空白组大鼠前列腺组织CTGF呈阴性表达，与各组有显著差异（P＜0.01）；模型组呈强阳性表达，与各组有显著差异（P＜0.01）；与阳性组相比，各组均有差异性（P＜0.01或P＜0.05）。结果显示前列腺炎Ⅰ号各剂量组均能抑制CTGF的表达，其中，中、大剂量组效果更佳，见图2、表2。

图2 各组大鼠前列腺组织CTGF染色（免疫组织化学 ×200）

表2 大鼠前列腺组织免疫组化（CTGF）染色结果分析

讨 论

慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征是男科较为常见的疾病之一，其病因和发病机制尚未完全明确，临床治疗效果不佳，中医辨证治疗有一定的特色和优势[5]。据有关学者研究显示，CP患者后期前列腺质地变硬，病理检查可见不同程度的纤维化，给临床治疗带来一定的困难[6]。

TGF-β1为一种强效致纤维化因子，具有调节免疫应答、刺激细胞外基质分泌与沉积的功能，在组织器官纤维化过程中发挥着重要作用[7]。CTGF可与不同受体结合而发挥其生物效应，广泛参与机体组织的纤维化、创伤修复、疤痕增生、软骨形成和胚胎发育等生理病理过程[8]。有关学者前期研究表明，TGF-β1、CTGF可能参与了CNP及其纤维化发病过程[9]，因此，通过检测前列腺组织中TGF-β1、CTGF的表达水平，对前列腺炎治疗效果的评价具有较高的参考价值。

前列腺炎Ⅰ号由萆薢、石菖蒲、台乌药、益智仁、威灵仙、冬瓜子、白芷、马鞭草、茯苓、皂角刺、菟丝子、五味子、水蛭等组成，其中台乌药、益智仁、菟丝子益肾补虚，萆薢、威灵仙、冬瓜子、白芷、马鞭草清热利湿，皂角刺、水蛭活血通络止痛，诸药合用共奏益肾清利活血之功。现代临床研究证实，该方具有改善局部微循环、抗炎镇痛、缓解平滑肌痉挛并调节局部组织免疫功能的功效[1,2]。前期实验研究表明，前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠血清细胞因子IL-2、IL-6的表达具有显著的抑制作用[10]。

本次实验采用自身免疫性造模方法，其模型持续时间较长、稳定可靠，具有较好的病理特异性，与人CNP病变机理较为相似，国际公认度高[11]。研究显示，前列腺组织中TGF-β1、CTGF的表达与慢性前列腺炎的病变程度具有相关性；前列腺炎Ⅰ号各剂量组对CNP大鼠前列腺组织中TGF-β1、CTGF的表达具有显著的抑制作用，其中中、大剂量组疗效更佳。表明前列腺炎Ⅰ号能有效抑制CNP大鼠前列腺组织的纤维化，改善前列腺炎的病变程度，对慢性非细菌性前列腺炎尤其是病程较长的患者具有较高的推广应用价值。

1 曾庆琪, 吉庆, 谭广兴, 等. 前列腺炎Ⅰ号颗粒治疗慢性盆腔疼痛综合征的临床研究. 长春中医药大学学报2012; 28(2): 211-212

2 朱勇, 杨凯, 曾庆琪. 曾庆琪教授经验方前列腺炎Ⅰ号.中国性科学 2013; 22(10): 81-83

3 周青, 何清湖, 田雪飞, 等. 麝香配伍乳香促虎杖提取物治疗慢性非细菌性前列腺炎的动物实验研究. 中华男科学杂志 2012; 18(5): 460-465

4 宋国宏, 李文玉, 张晨, 等. 免疫法制作大鼠非细菌性前列腺炎模型的量效关系研究. 中华男科学杂志 2011; 17(7): 586-590

5 朱勇, 刘正建, 曾庆琪. 慢性盆腔疼痛综合征的中医治疗现状. 中国男科学杂志 2013; 27(2): 63-66, 69

6 Niekel JC. Recommendations for the evaluation of patients with prostatitis.World J Urol2003; 21(2): 75-81

7 Gressner AM, Weiskirchen R, Breitkopf K, et al. Roles of TGF-beta in hepatic fibrosis.Front Biosci2002; 7: d793-d807

8 Oemar BS, Luscher TF. Connective tissue growth factor, Friend or foe?Arterioscler Thromb Vasc Biol1997; 17(8): 1483-1489

9 谭丹, 张唯力, 张建华, 等. 慢性非细菌性前列腺炎大鼠前列腺组织中TGF-β1、CTGF 的表达及意义. 中国男科学杂志 2008; 22(5): 22-25, 34

10 曾庆琪, 朱勇, 孙磊, 等. 前列腺炎Ⅰ号对CNP大鼠血清IL-2、IL-6含量的影响. 世界中西医结合杂志 2013; 8(10): 1058-1060, 1062

11 韩蕾, 周晓辉. 慢性非细菌性前列腺炎动物模型的研究进展.中国实验动物学报 2008; 16(2): 157-159

（2014-05-20收稿）

Effect of No.I decotion for prostatitis on the expressions of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of rat models with chronic nonbacterial prostatitis

Zhu Yong1,2, Sun Lei3, Wu Yunhao1,Yang Kai1, Jiao Gangliang1, Niu Peining1, Zeng Qingqi3**
1. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China;
2. TCM Hospital of Yancheng City Aff liated to Nanjing University of Chinese Medicine; 3. Jiangsu Jiankang Vocational College

Zeng Qingqi, E-mail: zengqq111@126.com

ObjectiveTo study the mechanism of No.I decotion in the treatment of CNP rats with chronic prostatitis.MethodsTotal of 70 rats were divided into 6 groups including normal contrast group (treated with normal saline 10ml•kg-1), model contrast group (treated with normal saline 10ml•kg-1), yang contrast group (treated wih qianlieshule 2.4g•kg-1), No.I decotion for prostatitis low-dose group (treated with10g•kg-1), middle-dose group (treated with 20g•kg-1), high-dose group (treated with 40g•kg-1). Rats in normal contrast group were injected subcutaneously with with 1 mL normal saline, and rats model in the other groups were done using self-immunitymodeling method, 30 days later the rats were retreated again,45 days later,they were administrated with drug mentioned above. 28 days later, prostate tissue of rats were resected for analysis of the amount of TGF-β1 and CTGF using immunohistochemical staining.Resultsthat in The levels of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of the rest groups were much higher than that in normal contrast group, the difference was signif cant(P<0.05). Compared to that in the model contrast group, the amount of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissueof the rest groups were signif cantly increased(P<0.05). The levels of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of other groups were signif cantly changed (P<0.05) as compared with that in yang contrast group.ConclusionEvery dose group of No.I decotion for prostatitis all effectively inhibited the expressions of TGF-β1 and CTGF in prostatic tissue of CNP rat models and alleviate the f brosis severity of prostatic tissue, of which the middle and high dose groups were more effective.

prostatitis/drug thrapy; transforming growth factor beta1

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.004

R 697.33

资助: 江苏省“六大人才高峰”项目（编号：WS-049）**

, E-mail: zengqq111@126.com