miR-361-5p对激素非依赖前列腺癌细胞PC3增殖、侵袭的影响*

刘大闯陶 陶许 斌陈恕求刘春辉张 磊卢 凯陈 明**韩从辉

1. 东南大学附属中大医院泌尿外科（南京 210009）;

2. 东南大学附属徐州市中心医院泌尿外科; 3. 徐州医学院附属徐州临床学院泌尿外科

·论 著·

miR-361-5p对激素非依赖前列腺癌细胞PC3增殖、侵袭的影响*

刘大闯1-3陶 陶1许 斌1陈恕求1刘春辉1张 磊1卢 凯1陈 明1**韩从辉2,3**

1. 东南大学附属中大医院泌尿外科（南京 210009）;

2. 东南大学附属徐州市中心医院泌尿外科; 3. 徐州医学院附属徐州临床学院泌尿外科

目的探讨mirR-361-5p在激素非依赖性前列腺癌细胞PC3中的表达和作用。方法采用qRT-PCR检测转染后的PC3中miRNA-361-5p的表达情况，用CCK-8和克隆形成实验检测转染后的PC3细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的变化，Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果qRT-PCR检测结果显示PC3中miR-361-5p含量低，脂质体法有较高的转染效率。CCK-8与克隆形成实验表明在PC3中升高miR-361-5p能够抑制前列腺癌细胞的活性和增殖能力。流式细胞检测发现miR-361-5p可增加细胞阻滞在G0/G1期和凋亡的比例。Transwell实验中，转染miR-361-5p后细胞通过小室的数量明显减少。结论 miR-361-5p能够抑制PC3的增殖与侵袭能力，从而发挥抑癌的作用。

前列腺肿瘤; miR-361-5p; 细胞增殖; 肿瘤侵袭力

前列腺癌在美国发病率极高[1]，近年来前列腺癌在我国发病率及检出率呈明显上升趋势[2]。但是前列腺癌的具体病因目前尚不完全清楚，并且最终都会向去势抵抗性转化，它使得疾病几乎不可治愈[3]。微小RNA（microRNAs，miRNAs）属于非编码RNA（成熟的miRNAs的长度通常为18～25个核苷酸，不能编码形成蛋白质），主要通过在转录后水平调控基因表达，在人类基因组中miRNAs 调控大约1/3的蛋白编码基因[4]，控制细胞的凋亡、增殖、分化、代谢以及个体的发育和肿瘤的发生、发展以及耐药[5]。我们在microRNAs 芯片及后续的qRT-PCR验证中发现，与激素依赖性前列腺癌相比，去势抵抗性前列腺癌中miR-361-5p表达显著降低。此前关于miR-361-5p在前列腺癌中的作用及miR-361-5p在去势抵抗性前列腺癌表达缺失的机制尚不清楚。

材料与方法

一、材料

（一）细胞系

人前列腺癌细胞株PC3细胞由中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心提供。

（二）主要试剂

F12K-DMEM培养基（美国Gibco 公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），青霉素-链霉素双抗生素（上海捷瑞生物公司），0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司），hsa-miR-361-5p mimics（5′-ACCCCUGGA GAUUCUGAUAAUU-3′） 与negative control（NC: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′）（均由上海吉玛制药技术有限公司合成），Opti-MEM培养基（美国Invitrogen 公司），脂质体Lipofectamine 2000（美国Invitrogen 公司），Trizol（美国Invitrogen公司），Hairpin-itTM miRNAs RT-PCR Quantitation Kit（上海吉玛制药技术有限公司），CCK-8 Kit（中国碧云天生物技术研究所），结晶紫染色液（中国碧云天生物技术研究所），甲醇（广东汕头市西陇化工厂），细胞周期试剂盒（杭州联科生物公司），annexin V-FITC/ PI细胞凋亡试剂盒（济南UBio生物科技公司），Transwell小室（美国Milipore公司）。

二、实验方法

（一）细胞培养及转染

以含10%胎牛血清、1%青-链双抗的F12KDMEM完全培养基在37 ℃、5% CO2、95%饱和湿度的细胞培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，每周传代2～3次。选择对数生长期PC3细胞，转染前1d，以0.25%胰蛋白酶消化细胞，90×g，离心3min，以无抗生素F12K-DMEM培养基制成单细胞悬液（6×105/孔）接种于的6孔培养板中（每孔含2mL不含抗生素的完全培养基），细胞密度约为5× 104/mL，24h内在37℃、5%CO2条件下培养至细胞融合约60%左右可以用于转染，将4μg hsa-miR-361-5p mimics和4μg NC分别加入250μL Opti-MEM 培养基中，吹匀；将5μL Lipofectamine 2000加入另一250μL Opti-MEM培养基，吹匀；5min后，将两管液体混匀，室温放置30min；将上述500μL 混合物加入6孔板中，摇匀；将6孔板置入37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

（二）qRT-PCR检测miR-361-5p的表达

转染48h后Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计检测浓度，采用上海吉玛SYBR Green染料法miRNA逆转录实时定量PCR试剂盒（Hairpin-itTMmiRNAs RT-PCR Quantitation Kit），按试剂盒的操作说明行MMLV酶逆转录和定量PCR检测，以U6作为内参，2-ΔΔCT法计算相对表达量。

（三）CCK-8实验

转染12h后用胰酶消化，通过血球计数板计数后，以每孔2 000个细胞接种于96孔培养板， 37℃、5% CO2培养。分别于24h、48h、72h和96h，向每孔加入10μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育2h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度，每组设5个复孔。

（四）克隆形成实验

转染48h后，同上消化、计数，将200个细胞/孔接种于6孔板中，用完全培养基进行培养。每周更换两次培养基，14d后待克隆形成，吸除培养基，用PBS 轻洗细胞2遍后，甲醇固定15min，吸除甲醇，加入0.2%结晶紫染色液染色20min，PBS轻洗3次，室温自然晾干拍照获得图像，对超过50 个细胞的克隆进行计数。

（五）流式细胞仪检测细胞周期

转染48h后收集细胞，用PBS洗涤3次，加入预冷的75%乙醇（由0.01mol/L PBS稀释无水乙醇配制），吹打均匀，封口膜密封，于-20℃固定24h以上，以PBS洗涤后加入细胞周期固定液重悬细胞，4℃避光孵育20min后上流式细胞仪检测。

（六）流式细胞仪检测细胞凋亡

转染48h后收集细胞，PBS洗涤2次，用400μL 1×Binding Buffer悬浮细胞，浓度大约1×106cells/ mL，在细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后于4℃避光条件下孵育15min，加入10μL PI后轻轻混匀于4℃避光条件下孵育5min，1h内上机检测。

（七）Transwell侵袭实验

转染48h后收集细胞，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，24 孔板每孔加入600μL 含10%胎牛血清的完全培养基，将水化后预铺Matrigel的Transwell小室放入，上层加入上述无血清培养基重悬的细胞100μL，培养12h，从培养箱中取出24孔板，将Transwell小室取出，用PBS 轻洗两次，用棉签将水吸干并小心擦去Transwell小室微孔膜内层的Matrigel与细胞，将Transwell小室置于含95%甲醇600μL的24 孔板中，固定15min，将Transwell 小室放入PBS中，轻洗两次，用棉签将水吸干后，置于含结晶紫溶液600μL 的24 孔板中，染色20min，将Transwell 小室放置在载玻片上，切勿移动Transwell小室，在倒置显微镜下各取上、中、下、左、右5 个视野拍照，同时观察下层液体中有无细胞掉下，如有的话，也需进行计数，计算细胞平均值。

三、统计学处理

每组实验重复3次，数据采用SPSS 16.0软件处理。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、qRT-PCR检测miR-361-5p的表达

分别设置空转染组（MOCK组）、阴性对照（NC组）与hsa-miR-361-5p mimics（转染组）3组。转染48h后，qRT-PCR检测结果显示，MOCK组及NC组PC3细胞miR-361-5p表达量均低，转染组miR-361-5p表达量明显升高，与NC组相比和与MOCK组相比差异均具统计学意义（P＜0.01），NC与MOCK组相比差异无统计学意义，提示Lipofectamine2000转染能成功导入miR-361-5p，具有较高的转染效率，见图1。

图1 3组miR-361-5p的表达量比较

二、CCK-8实验检测细胞活性和增殖能力

转染组与NC组相比细胞活性及增殖能力明显降低，见图2。

图2 转染组与NC组细胞活性及增殖能力比较

三、克隆形成实验

转染组与NC组相比细胞形成克隆的能力明显降低，差异具统计学意义（P＜0.01），见图3。

四、流式细胞仪检测细胞周期

各细胞周期分析，转染组与NC组相比，细胞被阻滞在G1期的比例明显增高，差异具统计学意义（P＜0.01），见图4。

五、流式细胞仪检测细胞凋亡

转染组与NC组相比，细胞发生凋亡的比例明显增高，差异具统计学意义（P＜0.05）见图5。

六、Transwell侵袭实验

转染组与NC组相比，穿透Transwell小室的细胞明显减少，见图6。

图4 转染组与NC组细胞被阻滞在G1期的比例比较

图5 转染组与NC组细胞发生凋亡的比例比较

图6 转染组与NC组细胞侵袭力比较

讨 论

前列腺癌进展到去势抵抗性（包括激素非依赖性和激素难治性前列腺癌）之后，其治疗即陷入困境[6]。miRNA在物种进化过程中高度保守，以复杂的RNA表达调控网络形式参与细胞的分化、发育、增殖、死亡等生命活动中一系列的重要进程[7]。作为分子生物学研究的热点之一，miRNA在肿瘤发生发展过程中的作用及其调控机制日益受到重视[8,9]。近年来miRNA与前列腺癌的研究也成为热点，发现了与前列腺癌发生发展有关的一些miRNA，其作用机制都需进一步明确[10,11]。

编码miR361的基因位于Xq21.2，位于外显子9和10之间的一个内含子区CHM/choroideremia（无脉络膜，无脑回畸形，又称Rab护送蛋白1），产生两种成熟的microRNA即miR-361-3p和miR-361-5p，其中miR-361-5p占主导[12]。有研究采用miRNA芯片技术发现在临床无进展生存期、临床治疗失败的前列腺癌以及良性前列腺增生各组患者中miR-361-5p表达存在着差异[13]。也有文献报道miR-361-5p可能与前列腺癌有关[14]。在转移性前列腺癌中与非转移性前列腺癌相比miR-361-5p明显降低[15]。但miR-361-5p在前列腺癌的发生发展中起到什么样的作用目前还没有相关研究报道。关于miR-361-5p的研究也是刚刚起步，有报道证明miR-361-5p在人皮肤癌中靶向VEGFA抑制肿瘤生长和微血管形成[16]，miR-361在人类脐静脉内皮细胞中有与肽生长抑素的交互功能起到抗血管新生的作用[17]。但也有报道miR-361-5p通过介导上皮向间质转化促进宫颈癌的发生发展[18]，提示在不同的肿瘤中miR-361-5p可能起到不同的作用。miR-361也被报道与人类DNA甲基转移酶3有关，影响到人类DNA甲基化[19]。本实验通过qRT-PCR实验发现PC3中miR-361-5p含量低，转染miR-361-5p mimics可人为的提高PC3细胞中miR-361-5p的含量，并验证了该实验具有较高的转染效率。在成功转染后CCK-8和克隆形成，实验证明miR-361-5p可降低PC3细胞的活性和增殖能力。细胞的增殖与细胞的分裂速度、凋亡等有着密切的关系。细胞分裂速度减慢将明显降低肿瘤的生长速度，我们的研究表明miR-361-5p能够将细胞阻滞在G0/G1期，阻止细胞的分裂，并证明miR-361-5p能够促进PC3细胞凋亡，凋亡降低了细胞形成克隆的能力。Transwell侵袭实验证明miR-361-5p能够抑制PC3细胞的侵袭能力。

综上所述，我们发现miR-361-5p能够调节PC3细胞的细胞周期及凋亡，可能通过这两方面的作用进一步影响细胞增殖、侵袭等生物行为。但miR-361-5p的具体作用途径尚不明了，其具体作用机制仍需要我们进一步研究和探索。

1 Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2013.CA Cancer J Clin2013; 63(1): 11-30

2 Peyromaure EM, Mao K, Sun Y,et al. A comparative study of prostate cancer detection and management in China and in France.Can J Urol2009; 16(1):4472-4477

3 Egan A, Dong Y, Zhang H,et al.Castration-resistant prostate cancer: Adaptive responses in the androgen axis.Cancer Treat Rev2013; 40(3):426-433

4 Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.Cell2004; 116(2): 281-297

5 Ma JC, Dong C, Ji C. MicroRNA and drug resistance.Cancer Gene Ther2010; 17(8): 523-531

6 Feldman BJ, Feldman D. The development of androgenindependent prostate cancer.Nat Rev Cancer2001; 1(1): 34-45

7 Dalmay T. Mechanism of miRNA-mediated repression of mRNA translation.Essays Biochem2013; 54: 29-38

8 Jansson MD, Lund AH. MicroRNA and cancer.Mol Oncol2012; 6(6): 590-610

9 Shen J, Stass SA, Jiang F. MicroRNAs as potential biomarkers in human solid tumors.Cancer Lett2013; 329(2): 125-136

10 Yu JJ, Xia SJ. Novel role of microRNAs in prostate cancer.Chin Med J (Engl)2013; 126(15): 2960-2964

11 Pang Y, Young CY, Yuan H. MicroRNAs and prostate cancer.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2010; 42(6): 363-369

12 Afanasyeva EA, Hotz-Wagenblatt A, Glatting KH,et al. New miRNAs cloned from neuroblastoma.BMC Genomics2008; 9: 52

13 Schubert M, Spahn M, Kneitz S,et al. Distinct microRNA expression prof le in prostate cancer patients with early clinical failure and the impact of let-7 as prognostic marker in high-risk prostate cancer.PLoS One2013; 8(6): e65064

14 Song H, Liu Y, Pan J,et al. Expression prof le analysis reveals putative prostate cancer-related microRNAs.Genet Mol Res2013; 12(4): 4934-4943

15 Watahiki A, Wang Y, Morris J,et al. MicroRNAs associated with metastatic prostate cancer.PLoS One2011; 6(9): e24950

16 Kanitz A, Imig J, Dziunycz PJ,et al. The expression levels of microRNA-361-5p and its target VEGFA are inversely correlated in human cutaneous squamous cell carcinoma.PLoS One2012; 7(11):e49568.

17 Dal Monte M, Landi D, Martini D,et al. Antiangiogenic role of miR-361 in human umbilical vein endothelial cells: functional interaction with the peptide somatostatin.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol2013; 386(1): 15-27

18 Wu X, Xi X, Yan Q,et al. MicroRNA-361-5p facilitates cervical cancer progression through mediation of epithelial-to-mesenchymal transition.Med Oncol2013; 30(4): 751

19 Park CW, Zeng Y, Steer CJ. Human DNA methyltransferase 3a does not associate with microRNAs in the regulation of DNA methylation.J Cardiovasc Transl Res2010; 3(3): 290-295

（2014-01-28收稿）

Effects of miR-361-5p on proliferation and invasion in androgenindependent human prostate cancer cell line PC3*

Liu Dachuang1-3, Tao Tao1, Xu Bin1, Chen Shuqiu1,
Liu Chunhui1, Zhang Lei1, Lu Kai1, Chen Ming1**, Han Conghui2,3**
1. Department of Urology, Zhongda Hospital Aff liated with Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Department of Urology, Xuzhou Central Hospital Aff liated with Southeast University; 3. Department of Urology, Xuzhou
Clinical Institute Affliated with Xuzhou Medical College

: Chen Ming, Email: mingchenseu@gmail.com; Han Conghui, Email: conghuiseu@126.com

ObjectiveTo investigate the effects of mirR-361-5p on bilogical behaviors of androgen-independent human prostate cancer cellsPC3.MethodsThe expression of miR-361-5p in PC3 cells after transfection was detected by qRT-PCR. Cell viability and proliferation of PC3 cells trasfected with miR-361-5p were measured by Cell Counting Kit-8(CCK-8) assay and colony formation assay. Cell cycle and apoptosis of PC3 cells transfected with miR-361-5p were analyzed by f ow cytometry. The invasion ability of cell was evaluated by Transwell assay.ResultsThe results of qRTPCR showed that the expression of miR-361-5p in PC3 cells was low, indicating transfection eff ciency was higher using liposome method. Overexpression of miR-361-5p signif cantly inhibited the proliferation of PC3 cells. Cell cycle analysis of PC3 cells transfected with miR-361-5p showed that cell number in G0/G1 phase was high and cell apoptosis number waslow. MiR-361-5p signif cantly inhibited the number of cells migrated through Transwell chambers membrane.ConclusionThese findings suggest that miR-361-5p may be a tumor suppressor miR in PC3 and it can inhibit the proliferation and invasion ability of androgen-independent human prostate cancer cells.

prostatic neoplasms; miR-361-5p; cell proliferation; invasiveness

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.08.001

R 737.25

资助: 本课题受国家自然基金（81370849、81300472、81272557、81202034）、临床医学科技专项--新型临床诊疗技术攻关（BL2013032）、教育部博士点基金（20120092120071）、江苏省自然科学基金（BK2012336、BK2012647）、南京市科技发展项目（201201053）、东南大学新教师基本科研项目（3290002402）、江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（CXZZ13_0133）和中央高校基本科研业务费专项资金资助资助
**共同通讯作者: 陈明, Email: mingchenseu@gmail.com; 韩从辉, E-mail: conghuiseu@126.com