中链脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

张新胜，杨雪艳，王 觐，张 永，刘英华，徐 庆，于晓明，刘 钊，薛长勇

解放军总医院 营养科，北京 100853

中链脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响

张新胜，杨雪艳，王 觐，张 永，刘英华，徐 庆，于晓明，刘 钊，薛长勇

解放军总医院 营养科，北京 100853

目的观察中链脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响。方法采用WST-1试剂检测200 μmmol/ L浓度的不同脂肪酸：辛酸(C8∶0)、癸酸(C10∶0)、豆蔻酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、α-亚麻酸(C18∶3)对THP-1细胞活性的影响；建立ApoA1介导的胆固醇流出细胞模型；不同浓度脂肪酸(0 μmmol/L、100 μmmol/L、200 μmmol/L)干预富集3H-胆固醇的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24 h后，用液体闪烁计数仪检测并计算胆固醇的流出率。结果不同脂肪酸在200 μmmol/L浓度时，对THP-1细胞无细胞毒性作用(P＞0.05)；与空白组比较，ApoA1介导的细胞胆固醇流出明显增加(P＜0.05)；随着脂肪酸浓度的增加，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸对细胞胆固醇流出影响差异有统计学意义(P＜0.05)；在200 μmmol/L浓度时，C8∶0和C18∶3脂肪酸与对照组比较更能促进细胞胆固醇的流出(P＜0.05)，且C8∶0脂肪酸对促进胆固醇流出的影响明显高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸(P＜0.05)。结论中链脂肪酸C8∶0能够促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的流出，且在200μmmol/L浓度时明显优于其他脂肪酸。

中链脂肪酸；脂肪酸；巨噬细胞；胆固醇流出

材料和方法

1 细胞及材料 THP-1细胞株由北京协和医科大学细胞库提供；RPMI-1640培养基(改良型)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均购自Gibco公司；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、载脂蛋白A1(apolipoprotein，ApoA1)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)均购自Sigma公司；低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)购自上海生工生物工程有限公司；3H-胆固醇购自Perkin Elmer公司；6孔板、24孔板、96孔板及培养瓶购自Corning公司；WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自凯基生物公司；C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3脂肪酸均购自Sigma公司。

2 低密度脂蛋白的氧化修饰 用PBS将LDL终浓度调整为1.5 g/L，加入CuSO4，LDL终浓度为10 μm/L，置于37℃条件下充分氧化24 h后，装入透析袋，用含200 μm/L乙二胺四乙酸的PBS液中透析48 h，过滤除菌，BCA法定量蛋白质，用PBS调整蛋白质浓度为1 g/L，4℃保存备用。

3 细胞培养 THP-1细胞分别用含有10%胎牛血清DMEM培养液、RPMI-1640培养液，于37℃、5% CO2培养箱中静置培养。培养液中加入青霉素100 U/ml、链霉素100 g/ml。细胞离心换液后用培养液将细胞计数调整到4×105～ 8×105/ml(用计数板计量：细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10 000×稀释倍数)，准备用于下一步实验。

4 干预脂肪酸的配制 称量各种脂肪酸，用95%乙醇溶液配制成20 mmol/L的脂肪酸，再用无血清培养液(含20 mg/ml BSA)分别稀释成2 mmol/L、1 mmol/L浓度脂肪酸干预物备用，干预脂肪酸加入培养孔内最终浓度为200 μmmol/L、100 μmmol/L。

5 细胞活性的测定 按照WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒步骤，将培养好的THP-1细胞(细胞计数达到4×105～ 8×105/ml)，接种于96孔板置37℃，5% CO2细胞培养箱12 h，随机分为18组(n=6)，包括空白组(无细胞+100 μl培养液)、细胞空白组(100 μl培养液)、200 μmmol/L及100 μmmol/L浓度下8种脂肪酸干预组(C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3)。37℃下孵育2 h。酶标仪(波长450 nm)检测每孔吸光度。每组吸光度值减去空白组吸光度值得到各组实际吸光度值。细胞存活率=(干预物组实际吸光度值/对照组实际吸光度值)×100%。

6 油红O染色 在加有盖玻片的6孔板中，加入THP-1细胞，PMA诱导分化成泡沫细胞，吸掉培养液，PBS清洗3次后，50%异丙醇固定1 min，油红染色10 min，水性封片剂封片，显微镜下观察泡沫细胞形态。

7 胆固醇流出细胞模型的建立 将培养好的THP-1细胞接种于24孔板，同时每孔加入50 ng/ml PMA培养24 h，使其诱导分化成巨噬细胞。PBS液洗涤细胞，再加入Ox-LDL(50 μg/ml)、3H-胆固醇(2 μCi/ml，溶于乙醇，乙醇总浓度＜0.2%)、含10% FBS培养液共同孵育48 h后，PBS液再洗涤细胞后，随机分为2组(n=12)：空白组只加入无血清的培养液、对照组加入无血清含10 μg/ml ApoA1培养液，培育12 h后，用闪烁计数法检测培养液和细胞的3H-胆固醇放射活性每分钟计数值(Cpm值)。胆固醇流出率=(培养液Cpm值/总Cpm值)×100%，其中总Cpm值=(培养液Cpm值+细胞Cpm值)。

8 胆固醇流出率的测定 将培养好的THP-1细胞，接种于24孔板，按照上述方法，诱导分化成巨噬细胞，富集3H-胆固醇后，随机分为17组(n=7)，包括对照组、200 μmmol/L及100 μmmol/ L浓度下8种脂肪酸干预组(C8∶0、C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3)，按照分组加入不同脂肪酸干预物(其中对照组加入含2 mg/ml BSA的培养液)培育24 h后，用PBS液洗涤细胞，再分别加入无血清含10 μg/ml ApoA1培养液中培育12 h，用闪烁计数法检测培养液和细胞的Cpm值，计算胆固醇流出率。

9 统计学分析 采用SPSS17.0统计软件处理数据，所有数据均以±s表示。多组之间数据进行多因素方差分析及单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 THP-1巨噬细胞源性泡沫化 THP-1细胞由PMA诱导分化为泡沫细胞，经油红O染色后，发现胞内有大量脂滴的存在，符合泡沫细胞的形态。见图1。

2 200 μmmol/L浓度不同脂肪酸对THP-1细胞活性的影响 不同脂肪酸在200 μmmol/L浓度下对THP-1细胞无细胞毒性作用，各组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

图 1 THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞油红O染色Fig.1 Oil red O staining of THP-1 macrophage-derived foam cells (×40)

图 2 不同脂肪酸对THP-1细胞活性的影响Fig.2 Effects of different fatty acids on cell viability (×40)

3 胆固醇流出细胞模型的建立 与空白组比较，对照组(+ApoA1)THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出显著增加(P＜0.05)，见图3。ApoA1介导的胆固醇流出明显增加，提示胆固醇流出细胞模型复制成功。

4 中链脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响 多因素方差分析发现，随着脂肪酸浓度的增加(0 ～ 200 μmmol/L)，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸对胆固醇的流出差异有统计学意义(P＜0.05)，特别是C8∶0脂肪酸具有随着其浓度增加、胆固醇流出增加的趋势。当不同的脂肪酸都在相同的200 μmmol/L浓度时，C8∶0和C18∶3脂肪酸促进胆固醇的流出，且显著高于对照组(P＜0.05)。此外，C8∶0对促进胆固醇流出的影响显著高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸(P＜0.05)。见表1。

图 3 ApoA1介导的细胞胆固醇流出Fig.3 Effect of ApoA1 on cholesterol eff l ux

表1 不同脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇流出的影响Tab. 1 Effects of different fatty acids on cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells

讨论

巨噬细胞内胆固醇大量聚集形成泡沫细胞，在炎性因子的作用下沉积于血管壁下，这一过程是AS的早期病理基础。而RCT能够清除细胞内多余的胆固醇，减缓巨噬细胞泡沫化进程，延缓AS的发生和发展。胆固醇流出是RCT过程中的限速步骤，已成为防治AS研究的热点。

膳食脂肪酸被认为是影响AS发生、发展重要的营养因素，研究发现饱和脂肪酸增加血清低密度脂蛋白胆固醇水平，进而促进AS的发生[1]。而不饱和脂肪酸能够对抗AS的发展，如亚油酸能够降低血浆LDL-C水平而对抗AS形成，DHA或EPA能够降低动脉粥样硬化疾病的心血管并发症[1,5-6]。MCFA作为一种特殊的饱和脂肪酸，具有快速代谢、减少脂肪组织富集以及增加机体能量消耗的特点，近年来多数研究已经表明，MCFA能够减轻体质量，减少脂肪的堆积[7-8]。笔者研究团队发现，MCFA能够改善高胆固醇血症小鼠血清胆固醇、三酰甘油、LDL-C及HDL-C水平，促进了粪便的中性固醇和胆汁酸的排泄[4]。提示MCFA能够改善胆固醇代谢，防治AS的发生，进而预防和改善心血管疾病。本研究以THP-1巨噬细胞为研究对象，首先确认了在200 μmmol/L浓度下不同脂肪酸对THP-1巨噬细胞无细胞毒性作用，进一步胆固醇流出实验发现，随着脂肪酸浓度的增加(0 ～200 μmmol/L)，C8∶0、C18∶0、C18∶1和C18∶3脂肪酸对胆固醇流出的影响有显著差异，特别是C8∶0脂肪酸具有随着其浓度增加、胆固醇流出增加的趋势，而饱和脂肪酸C18∶0在100 μmmol/L浓度时，对胆固醇流出表现出抑制作用，说明了长链饱和脂肪酸对AS的不利影响。研究报道C18∶3能够促进胆固醇流出而降低泡沫细胞胆固醇聚集[9]。本研究同样发现，多不饱和脂肪酸C18∶3在200μmmol/L浓度时促进胆固醇的流出。Xie等[10]动物实验发现，辛酸(C8∶0)与油酸(C18∶1)及亚油酸(C18∶2)相比能够降低肝ApoB、三酰甘油及胆固醇的分泌。Wein等[11]研究发现，MCFA可以降低大鼠空腹胆固醇水平，表明了MCFA在胆固醇代谢方面优于长链脂肪酸。这些研究结果表明，MCFA在胆固醇代谢方面较其他脂肪酸具有显著优势。本研究在200 μmmol/L浓度时比较不同脂肪酸，发现C8∶0和C18∶3脂肪酸促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇的流出，此外，C8∶0对促进胆固醇流出的影响明显高于C10∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0、C18∶1、C18∶2脂肪酸。

有关研究报道C18∶3促进胆固醇流出的机制是促进ABCA1、ABCG1及SR-BI表达而增加ApoA1介导的胆固醇流出[12]。目前已知有三磷酸腺苷结合盒转运体超家族(ABCA1、ABCG1、 ABCG5、ABCG8)、7α-羟化酶(CYP7A1)及SR-BI等参与胆固醇RCT过程，并受核受体肝X受体(LXR-α)及过氧化物酶增殖物激活受体-α、(PPAR-α)调节。有关中链脂肪酸C8∶0如何促进胆固醇的流出还需要我们进一步探讨。本实验只是通过细胞实验观察到中链脂肪酸C8∶0促进胆固醇流出效应，是否对于动物或人群同样具有效应，也需要进一步研究。

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Effects of medium-chain fatty acids on cholesterol efflux in THP-1 macrophages -derived foam cells

ZHANG Xin-sheng, YANG Xue-yan, WANG Jin, ZHANG Yong, LIU Ying-hua, XU Qing, YU Xiao-ming, LIU Zhao, XUE Changyong
Department of Nutrition, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XUE Chang-yong. Email: cnxcy@163.com

ObjectiveTo observe the effect of medium-chain fatty acids on cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells.MethodsWST-1 were used to detect the effect of different fatty acids (in the presence of 200 μmmol/L) on the cell viability of THP-1, including caprylic acid (C8∶0), capric acid (C10∶0), myristic Acid (C14∶0), palmitic acid (C16∶0), stearic acid (C18∶0), oleic acid (C18∶1), linoleic acid (C18∶2) and alpha linolenic acid (C18∶3). The cell model of cholesterol eff l ux that mediated by ApoA1 was established. Different fatty acids (0 μmmol/L, 100 μmmol/L and 200 μmmol/L) were used to intervene the THP-1 macrophages-derived foam cells of enriched3H-cholesterol, then after 24 hours, the rate of cholesterol eff l ux were determined by the liquid scintillation.ResultsIn the presence of 200 μmmol/L, different fatty acids showed no adverse effect on the viability of THP-1 cell line (P＞0.05). Compared with the blank group, ApoA1 mediated cholesterol eff l ux was signif i cantly higher (P＜0.05). With the increase of concentration of fatty acids, C8∶0, C18∶0, C18∶2 and C18∶3 showed signif i cant effects on cholesterol eff l ux (P＜0.05). In the concentration of 200 μmmol/L, C8∶0 and C18∶3 fatty acids signif i cantly promoted cholesterol eff l ux comparing with control group (P＜0.05), furthermore, C8∶0 fatty acid promoted cholesterol eff l ux was signif i cantly higher than in C10∶0, C14∶0, C16∶0, C18∶0, C18∶1 and C18∶2 fatty acids groups (P＜0.05).ConclusionThe medium-chain fatty acid C8∶0 can increase cholesterol eff l ux in THP-1 macrophages-derived foam cells and is obviously higher than that of other fatty acids when its concentration is 200 μmmol/L.

medium-chain fatty acids; fatty acids; macrophages; cholesterol eff l ux

R 589.2

A

2095-5227(2014)12-1245-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.12.019

时间：2014-09-18 09:41

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140918.0941.001.html

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是导致心血管疾病发生、发展的主要病理基础，而引起AS的主要原因就是血胆固醇水平的升高，进而导致病变血管处胆固醇的堆积，巨噬细胞过度荷脂形成泡沫细胞，沉积于动脉壁形成早期的粥样斑块。胆固醇的逆转运(reverse cholesterol transport，RCT)过程可将细胞内多余的胆固醇从细胞中流出并转移至高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，再经血液循环转运到肝进行代谢。因此，巨噬细胞的RCT对动脉粥样硬化的形成起着关键的作用，也是目前认为对抗AS发生的主要机制[1]。膳食脂肪酸被认为是影响AS发生、发展的重要营养因素，而中链脂肪酸(medium chain fatty acids，MCFA)为一种特殊的饱和脂肪酸，是由8 ～ 12个碳原子构成的脂肪酸，主要来源于母乳、牛奶及其制品、棕榈仁油和椰子油等，最常见的MCFA有C8∶0和C10∶0脂肪酸。MCFA与健康的关系日益受到重视，临床试验研究发现，MCFA除了能够降低体质量、改善体脂外，还能够显著降低高脂血症患者三酰甘油和胆固醇水平[2-3]。动物实验研究同样发现，MCFA能够改善高胆固醇血症小鼠血清胆固醇、三酰甘油、LDL-C及HDL-C水平，还能促进粪便的中性固醇和胆汁酸的排泄[4]。因此，MCFA对胆固醇代谢具有明显的调节效应，本文以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象，与其他脂肪酸比较，观察中链脂肪酸对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响，探讨MCFA在防治AS发生及发展中的作用。

2014-05-14

国家自然科学基金项目(81172667)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(8117 2667)

张新胜，男，在读硕士，主治医师。Email: zhangxinsheng198431@126.com

薛长勇，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主任。Email: cnxcy@163.com