XPD基因多态性与非霍奇金淋巴瘤的相关性

李素霞，朱宏丽，郭 搏，杨 洋，王红艳，孙敬芬，曹永彬

1解放军总医院 老年血液科，北京 100853；2解放军总医院 血液科，北京 100853；3解放军总医院第一附属医院 血液科，北京 100048

XPD基因多态性与非霍奇金淋巴瘤的相关性

李素霞1，朱宏丽1，郭 搏1，杨 洋1，王红艳2，孙敬芬2，曹永彬3

1解放军总医院 老年血液科，北京 100853；2解放军总医院 血液科，北京 100853；3解放军总医院第一附属医院 血液科，北京 100048

目的探讨核苷酸剪切修复基因-着色性干皮病基因D(Xeroderma pigmenting group D，XPD)单核苷酸多态性与非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)及其亚型发病风险的关系。方法选取解放军总医院、解放军总医院第一附属医院2011年3月- 2013年9月282例NHL患者和231例正常对照者为研究对象，采用SNaPshot方法检测XPD的2个基因rs1799793、rs13181的基因多态性，分析其在NHL组和正常对照组中基因型和等位基因频率分布的差异。采用Logistic回归分析计算各个SNP的等位基因的比值比(odd ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)。结果XPD rs1799793、rs13181在NHL组和正常对照组中基因型和等位基因频率分布无统计学差异。XPD rs1799793、rs13181组合基因型在对照组和NHL组中无统计学差异。对NHL亚型分析显示，与对照相比较，弥漫大B细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、其他B细胞性淋巴瘤发病风险无差异。结论本组人群XPD rs1799793、rs13181基因多态性与NHL组及其亚型的发病无明显相关性。

着色性干皮病基因D；非霍奇金淋巴瘤；单核苷酸多态性

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)是一种常见的血液系统恶性肿瘤，其发病危险因素除了病毒感染、大剂量辐射、接触氯酚、苯、农药、服用某些免疫抑制剂导致免疫功能障碍等，遗传易感性作用也日益突出。DNA损伤后个体修复能力的差异是决定遗传易感性的主要因素。着色性干皮病基因D(xeroderma pigmenting group D，XPD)又被称作切除修复交叉互补基因2(excision repair cross-complementing group 2，ERCC2)，作为一种重要的DNA修复基因，在肿瘤研究中发现其基因多态性与多种肿瘤的易感性有关[1-6]。我们以病例对照方法，探讨中国北方汉族人群XPD基因多态性与NHL患病风险的关系。

对象和方法

1 研究对象 非霍奇金淋巴瘤组患者为解放军总医院、解放军总医院第一附属医院血液科患者。鉴于种族因素影响，本研究对象选自2011年3月-2013年9月经病理明确诊断的中国北方(长江以北地区)汉族NHL患者282例，其中男性203例，女性79例，平均年龄48.87岁。按照2008年淋巴组织肿瘤WHO新分类法，弥漫大B细胞淋巴瘤159例，T细胞性淋巴瘤52例，滤泡性淋巴瘤25例，其他B细胞性淋巴瘤46例。对照组为同期解放军总医院健康查体合格无肿瘤的中国北方汉族人群。

2 样本采集 两组均取外周静脉血2 ml，EDTA抗凝，应用Omega公司血标本DNA提取试剂盒按照操作步骤提取DNA，于-20℃保存。

3 主要试剂及仪器 SNaPshot试剂盒(ABI PRISM®SNaPshotTMMulitiplex Kit，ABI公司)，PCR纯化试剂盒(ABI公司)，Taq酶(TAKARA Taq Polymeras，TAKARA公司)，凝胶成像仪(BioSens SC 810B，上海山富科学仪器有限公司)，9700 PCR仪(ABI公司)，3730XL测序仪(ABI公司)。

4 XPD基因rs1799793、rs13181基因型检测：1)引物设计合成：根据SNP位点序列信息，使用Primer5软件设计扩增引物和延伸引物并合成(表1)。2)预扩增及纯化：PCR预扩增反应体系为10 μl(包括10×缓冲液1.0 μl，dNTP混合物(2.5 mmol/L) 0.8 μl，HotstarR Taq DNA聚合酶(5 U/μl) 0.1 μl，PCR引物(32 mol/L)各0.2 μl和DNA模板(50 ng/μl)1 μl，扩增程序为：95℃ 5 min、95℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s共35个循环；72℃ 10 min。PCR扩增后取反应产物2 μl行琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物质检。之后取PCR产物15 μl加入1 U CPI，37℃反应1 h，75℃变性15 min进行产物纯化。3)延伸反应及纯化：取纯化好的PCR产物、SNaPshot引物混合物、SNaPshot荧光混合物(含AmpliTaqDNA多聚酶和不同荧光标记的ddNTP)组成一个PCR反应体系。SNaPshot反应程序为96℃变性10 s，然后96℃变性10 s，53℃退火5 s，60℃延伸30 s，25个循环。之后60℃延伸30 s，4℃保存。延伸反应产物10 μl加2.5 μl EDTA，18 μl无水乙醇，13 000 r/min，30 min，垫上吸水纸倒甩5 s，加入70%的冰乙醇，13 000 r/min，15 min，垫上吸水纸倒甩5 s，烘干10 min进行纯化。4)3730XL测序仪检测：将SNaPshot产物稀释20倍.每份样品中加入高纯甲酰胺8.6 μl，分子内标0.9 μl，SNaPshot纯化产物0.5 μl，总体积10 μl，95℃变性5 min，迅速冷冻4 min。在ABI3730XL型DNA序列检测仪上进行毛细管电泳，运行Gene-Mapper4.0软件分析实验结果。

5 统计学分析 采用拟合优度χ2检验，计算基因型频数分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，检验样本的群体代表性；采用χ2检验统计两组间等位基因的频率分布的差异，采用Logistic回归分析计算各个SNP的等位基因以及各个突变组合基因型的比值比(odd ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)，统计分析用R统计软件进行。

表1 XPD基因SNP扩增及延伸引物序列Tab. 1 XPD gene SNP amp lif cation p rimer and extension primer

结 果

1 两组人口学特点 本研究病例组和对照组均选自中国北方汉族人群，231例对照组中男性138例(59.71%)，女性93例(40.26%)，年龄分布为13 ～87岁，平均年龄45.59岁。282例非霍奇金淋巴瘤组中男性203例(71.99%)，女性79例(28.01%)，年龄分布为12 ～ 89岁，平均年龄48.87岁，病例组和对照组年龄差异无统计学意义，性别差异有统计学意义。所有研究对象均知情同意并自愿参加。

2 XPD基因型及等位基因频率分布 rs1799793、rs13181基因型分布在NHL组和正常对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，其基因型和等位基因频率分布在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

3 XPD基因型分布与NHL亚型发病风险的相关性 将281例NHL患者分为弥漫大B细胞淋巴瘤、T细胞性淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和其他B细胞淋巴瘤4种亚型，结果表明，rs1799793、rs13181基因型分布在正常对照组与4种NHL亚型中无统计学差异。见表3。

4 XPD组合基因型与NHL及其亚型的相关性 将野生纯合型基因型编码为WT，突变纯合型和杂合型基因型编码为VT。XPD基因rs1799793、rs13181的4种组合基因型为WT-WT、WT-VT、VT-WT、VT-VT，以WT-WT为参考组合基因型，Logistic回归计算其他3种组合基因的OR值和P值。结果显示XPD的3种突变组合基因型在对照组和非霍奇金淋巴瘤组及其亚型组均无差异。见表4、表5。

表2 XPD rs1799793，rs13181 位点基因型和等位基因频率分布Tab. 2 Genotype distributions and allele frequencies of exam ined polymorphism between cases and controls, as well as their prediction for NHL risk

表3 XPD 基因多态性与NHL及其亚型发病相关性Tab. 3 Genotype distributions of XPD exam ined polymorphism between cases and controls, as well as their prediction for NHL subtype risk

表4 XPD组合基因型与NHL发病相关性Tab. 4 Correlation between the combined XPD genotypes and risk of NHL (n,%)

讨 论

随着人类对疾病发生发展过程认识的不断加深，目前研究认为，DNA修复基因多态性是决定机体肿瘤易感性的一个重要因素。着色性干皮病基因D位于19号染色体长臂q13.3，由23个外显子组成，编码760个氨基酸。XPD蛋白是Ⅱ型转录因子H复合体的重要组成部分，涉及核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)和基因转录。作为一种重要的DNA修复基因，XPD基因突变减少其复合物的活性并引起修复和转录缺陷。研究显示，XPD基因多态性与肺癌、食管癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤的发生存在相关性[1-10]。

影响DNA修复基因单核苷酸多态性与肿瘤易感性关系的因素纷繁复杂，如不同DNA修复基因的多态性之间或同一DNA修复基因的不同多态性位点之间的交互作用、DNA修复基因的多态性与其他肿瘤相关基因的多态性之间的交互作用、接触致癌物的类型、剂量、接触方式和时间等、种族因素以及性别、年龄、生活习惯、内分泌功能、营养状况等。本研究以中国北方汉族人群病例对照研究为基础，采用SNapShot联合毛细管电泳的方法检测了XPD rs1799793、rs13181基因多态性，比较不同基因型与NHL及其亚型发病风险的关系，同时对XPD rs1799793、rs13181这两个不同多态性位点的组合基因型进行了分析。结果显示，rs1799793、rs13181基因多态性与NHL及其亚型的发病无明显相关性，在进一步的XPD rs1799793、rs13181突变组合基因型研究分析显示，两个不同多态性位点的突变组合基因型同样与NHL及其亚型的发病无相关性。这与国外一些关于XPD与NHL的相关性研究结果一致[11-15]。与国内宋宝等[16]对山东地区NHL患者研究XPD rs1799793、rs13181均与NHL或NHL亚型的发病无相关性的结果也一致。英国学者Worrillow等[17]研究了XPD rs13181、rs1799793、rs238406多态性与非霍奇金淋巴瘤的相关性，结果显示上述基因多态性与非霍奇金淋巴瘤发病无相关性，但XPD rs13181 (Lys751Gln)Gln等位基因可以使弥漫大B细胞淋巴瘤的发病风险降低2倍(OR：0.56，95% CI：0.34 ～0.92，P=0.02)。

表5 XPD 组合基因型与NHL亚型发病相关性Tab. 5 Correlation between the combined XPD genotypes and risk of NHL subtypes

目前对于XPD的基因多态性与恶性血液系统肿瘤的发病风险、个体化治疗、治疗并发症以及预后判断的相关性也有研究[18-24]。如Monroy等[18]对200例霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)患者的研究显示XPD rs13181与HL的发病无相关性。而Storm等[19]对170例中危AML患者预后相关性的研究结果显示XPD rs13181对中危急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者的总生存期有影响，rs13181带有突变基因(AC/CC)组的AML患者生存期明显短于野生型(AA)组患者(中位生存期22个月vs 40个月，P=0.03)。瑞金医院Shi等[20]对15个基因的42个多态性位点与AML发病及预后的相关性研究，结果显示XPD rs13181带有突变的杂合子基因型增加AML的风险(OR：1.637；95% CI：1.118 ～ 2.395)。西班牙学者Cibeira等[21]研究了包括XPD rs13181在内的15个不同基因的19个多态性位点与沙利度胺治疗复发或难治多发性骨髓瘤患者的反应率和生存期的相关性，结果显示XPD rs13181与对药物的反应率和生存期无关。土耳其学者Ozdemir等[22]研究了XPD基因多态性与儿童白血病、淋巴瘤患者发生发热性中性粒细胞减少症、黏膜炎的相关性研究。该研究包括29例Brukitt淋巴瘤和61例急性淋巴细胞白血病儿童患者，结果显示XPD rs13181、rs1799793基因多态性与上述疾病无关。此外还有少量的XPD基因多态性与继发性AML预后、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症、骨髓纤维化出现白血病转化的相关性研究[23-24]。

由于多种因素的影响，XPD基因多态性与多种血液系统疾病的相关性研究结果不同。本研究初期结果虽然显示XPD rs13181、rs1799793与NHL的发病无明显相关性，但由于样本例数较少，今后的研究中将继续扩大研究范围和研究对象，充分考虑这些影响因素，并进行详细分层研究，尽可能明确XPD基因单核苷酸多态性与NHL及其他血液系统恶性疾病易感性、疾病预后、治疗并发症之间的关联。

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Correlation between XPD genetic polymorphism and non-Hodgkin's lymphoma

LI Su-xia1, ZHU Hong-li1, GUO Bo1, YANG Yang1, WANG Hong-yan2, SUN Jing-fen2, CAO Yong-bin3

1Department of Geriatric Hematology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Hematology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;3Department of Hematology, The First Aff liated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048, China
Corresponding author: ZHU Hong-li． Email: bjzhl202@sina．com

ObjectiveTo explore the correlation between Xeroderma pigmenting group D (XPD)gene polymorphisms and non-Hodgkin lymphoma (NHL) risk．MethodsA case-control study with 282 non-Hodgkin lymphoma patients and 231 control subjects were conducted to investigate the role of two XPD gene polymorphisms (rs1799793, rs13181) on susceptibility to non-Hodgkin lymphoma by SNaPshot． A ll statistical analysis were done with R software． Genotype and allele frequencies of XPD were compared between patients and control group by chi-square test． Crude and adjusted odds ratios and 95% conf dence intervals were calculated by logistic regression based on genetic different models．ResultsThere was no signif cant difference between the control group and NHL or NHL subtype cases in genotype and variant genotype frequency． Analysis of XPD rs1799793, rs13181 showed that no combined genotype was associated with risk of NHL overall or four kinds of subtypes of NHL．ConclusionThere is no close relationship between XPD polymorphism (rs1799793, rs13181) and the risk of NHL or each histologic subtype of NHL．

xeroderma pigmenting group D; non-Hodgkin lymphoma; single nucleotide polymorphism

R 733.1

A

2095-5227(2014)08-0853-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.022

2014-04-02 17:30

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140402.1730.001.html

2013-12-04

“重大新药创制”科技重大专项(2008ZXJ09001-019)；解放军总医院南楼青年创新基金(NQ201107)

Supported by “Major Country to Create a Special New Drugs”S&T Major Project(2008ZXJ09001-019)

李素霞，女，博士，副主任医师。研究方向：血液病诊断及治疗。Email: lisuxia301@163.com

朱宏丽，女，主任医师，硕士生导师。Email: bjzhl202@ sina.com