miR-146a促进动脉粥样硬化斑块形成调控机制研究

孟凡磊，王 超，霍晓川，关 宁，罗俊生

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

miR-146a促进动脉粥样硬化斑块形成调控机制研究

孟凡磊，王 超，霍晓川，关 宁，罗俊生

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

目的探讨miR-146a对动脉粥样硬化斑块的影响及其机制。方法利用miR-146a增强剂(miR-146a mim ic)和miR-146a拮抗剂(miR-146a inhibitor)转染大鼠外周血单核巨噬细胞，转染成功后予巨噬细胞泡沫化。油红O染色和脂质染色的半定量分析miR-146a对细胞的脂质堆积情况的影响。Western blot检测胆固醇酯水解酶(cholesteryl ester hydrolase，CEH)、ABCA1和ABCG1的表达情况。结果Western blot检测显示，miR-146a mimic转染组的CEH表达明显降低，miR-146a inhibitor转染组的ABCA1和ABCG1表达量较对照组和miR-146a mimic转染组明显增多。油红O染色显示miR-146a mimic转染组、对照组和miR-146a inhibitor转染组的阳性细胞比例分别为82.1%±3.1%、73.2%±0.16%和16.25%±2.1%。结论miR-146a能够抑制大鼠外周血单核巨噬细胞细胞内CEH的表达，进而阻碍游离胆固醇的外流，最终导致动脉粥样硬化斑块的形成。

泡沫细胞；胆固醇酯水解酶；ABCA1；ABCG1；微小RNA

由动脉粥样硬化引起的缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)占脑血管病(cerebrovascular disease，CVD)的70% ～ 80%，其具有较高的发病率和致残率，是危害人类健康的最为常见的疾病之一。现已证实动脉粥样硬化的形成与泡沫细胞内过剩胆固醇和胆固醇酯有着密切的关系[1]。研究发现胆固醇酯水解酶(cholesteryl ester hydrolase，CEH)能够增加细胞内游离胆固醇和胆固醇酯的外流，抑制泡沫细胞的形成[2-3]。微小RNA(miRNA)是一种非编码RNA，通过导致靶基因的沉默来调控真核基因的表达[4-5]。有学者认为miRNA拮抗剂能促进胆固醇的逆行转运(reverse cholesterol transport，RCT)，减少细胞内胆固醇和胆固醇酯含量[6]。同时，在胆固醇逆行转运过程中最重要的转运体ABCA1和ABCG1起到了通道蛋白载体的作用[7-8]。本研究通过观察分析miRNA对大鼠外周血单核细胞的胆固醇的逆行转运的影响，进一步探讨miRNA对胆固醇酯水解酶的作用机制，并为药物治疗缺血性脑血管病提供理论依据。

材料和方法

1 材料 胎牛血清(美国GIBCO公司)，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)(北京协生生物科技有限公司)，佛波酯(PMA)和油红O(Sigma公司)，大鼠淋巴细胞分离液(TBD sciences)，内参照β-actin(Santa Cruz公司)，CEH(HCEH1)兔多克隆一抗购于Sigma公司，ABCA1兔多克隆一抗、ABCG1兔多克隆一抗(Abcam公司)。

2 大鼠外周血单核细胞的分离提取与培养 取8 ～10 ml大鼠外周血，将其用0.9%氯化钠注射液对半稀释，加入等量的淋巴细胞分离液，于50 ml离心管中以1 500 r/min离心20 min后，小心吸取中间层和上层交接处的白细胞层于EP管中洗涤离心后，获得T淋巴细胞，于6孔板内备用，调整细胞浓度至1×106/孔。在37℃，5% CO2培养箱孵育培养4 h后的单个核细胞此时大部分贴壁，轻轻倒去未贴壁的淋巴细胞，用浓度为50 ng/ml的PMA刺激48 h，使之转化为巨噬细胞。

3 细胞分组及处理 将培养的巨噬细胞分为对照组，miR-146a mimic转染组(100 pmol刺激48 h)，miR-146a inhibitor转染组(100 pmol刺激48 h)然后各组应用氧化低密度脂蛋白(50 μg/ml)刺激24 h。

4 油红O染色和脂质半定量分析 将细胞以PBS冲洗3次，放在4℃、10%甲醛中固定10 min，用油红O方法染色：水洗5 min，60%异丙醇中放置5 min，新过滤的油红O染色10 min。60%异丙醇分化5 min，水洗5 min，Mayer氏苏木精明矾染液染色5 min，1% HCl分色及反蓝后，水洗5 min并照相。按Wads方法pI进行脂质染色的半定量分析，即根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。如果细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-”，细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+”，此即为油红O染色细胞；每玻片计数100个细胞。

5 Western blot检测相关蛋白表达 不同处理组泡沫化处理24 h后将细胞刮下，收集至EP管内。用TBS漂洗后加入裂解液裂解细胞，考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。取等量蛋白上样SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭抗体，分别加入1∶200倍稀释的CEH一抗、1∶500倍ABCA1一抗、1∶2 500倍ABCG1一抗过夜。TBST洗膜后加入二抗温育1 h，β-actin作为内参。TBS洗涤，加入ECL显影剂在暗室中显影。

6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。数据以表示，各组数据正态性和方差齐性检验，两样本均数比较采用t检验，检验水准α=0.05。

结 果

1 miR-146a对巨噬细胞泡沫化的影响 miR-146a inhibitor转染组细胞多呈椭圆形或者不规则形状，油红O染色阳性细胞明显减少，细胞核染为蓝色，细胞质红染不明显。而空白对照组和miR-146a mimic转染组可见大量的染色阳性细胞，细胞质大量红染，细胞核染蓝色，并且细胞体积部分增大，呈圆形或不规则形(图1)。其中，对照组的阳性细胞比例为73.2%±0.16%，miR-146a mimic转染组和miR-146a inhibitor转染组分别为82.1%±3.1%和16.25%±2.1%，与对照组相比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。可见miR-146a inhibitor转染组泡沫化程度有所下降，miR-146a mimic转染组泡沫化的程度有所增加。

2 miR-146a减少巨噬细胞CEH的表达并且降低了胆固醇的外流 Western blot检测结果显示，miR-146a mimic转染组比较对照组CEH表达明显降低(图2)，表明miR-146a的含量升高可以抑制CEH的表达。并且miR-146a inhibitor转染组的ABCA1和ABCG1表达量较对照组和miR-146a mimic转染组明显增多(图3)，由此我们认为miR-146a能够抑制与胆固醇外流相关的ATP结合盒转运体ABCA1和ABCG1的表达。

图 1 油红O染色显示miR-146a能促进大鼠外周血单核巨噬细胞转化为泡沫细胞(×400) A： 对照组； B： miR-146a m im ic转染组； C： miR-146a inhibitor转染组Fig. 1 Oil Red O staining show ing foam cells in control group(A), miR-146a m im ic transfected group(B), miR-146a inhibitor transfected group(C)

图 2 Western blot检测CEH表达水平Fig. 2 Western blot show ing expression level of CEH

图 3 miR-146a m im ic和miR-146a inh ibitor转染后Western b lot检测ABCA 1和ABCG 1蛋白表达情况 1： miR-146a m im ic转染组； 2： 对照组； 3： miR-146a inhibitor转染组Fig. 3 Western b lot show ing exp ression of ABCA 1 and ABCG1 protein in miR-146a m im ic transfected group (1), control group (2), miR-146a inhibitor transfected group (3)

讨 论

巨噬细胞吞噬脂类形成泡沫细胞，并且在血管壁上聚集是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的显著特征之一。由于血管内皮损伤后循环中的脂蛋白尤其是修饰的低密度脂蛋白(modified lowdensity lipoprotein，mLDL)被单核巨噬细胞摄取，并逐渐增加形成泡沫细胞[9-10]。随着泡沫细胞的脂质不断聚集，AS斑块体积不断增加，且伴随相应的炎症反应，从而增加其易损性并且容易引起斑块的破裂[11]。有研究发现，清除巨噬泡沫细胞内的胆固醇有逆转AS的作用[12]。CEH在体内组织细胞表达较为广泛，其中以巨噬细胞和肝表达最为显著[13]。在巨噬泡沫细胞中，CEH高表达使水解CEs的能力增强，释放FC增加，同时能使细胞表面通道蛋白例如ABCA1和ABCG1的表达量增加，在不同程度上促进了RCT的进程，抑制泡沫细胞的形成[11,14]。

近年来，miRNA作为治疗靶点指导疾病的诊断和药物的研究已经成为热点。且基于miRNA基因防治AS已经越来越受到学者重视。miR-146a对细胞的生物学过程有重要的调节作用，能够抑制IL-18的表达、调节巨噬细胞功能、促进血管平滑肌细胞增殖等作用[15-16]。研究证实miR-146a对脂质代谢具有调节作用，可以参与动脉粥样硬化形成的过程[17-18]。但miR-146a是否通过诱导CEH表达来调节泡沫细胞RCT的进程还未见报道。因此，我们通过以上的研究来观察它们是否存在联系。

我们通过转染大鼠外周血单核巨噬细胞miR-146a mimic，使巨噬细胞内miR-146a量增多，观察CEH的表达量是否有所变化。研究发现miR-146a组与对照组相比CEH的表达程度明显减低，据此我们推测miR-146a能通过某些信号通路来下调CEH的表达，促进泡沫细胞的形成。

AS的形成与泡沫细胞内脂质的聚集有密切的关系，故增加巨噬泡沫细胞胆固醇外流是防治AS的关键。因此，本研究通过油红O染色和Western blot观察分析各组泡沫细胞的形成情况、胆固醇逆行转运体ABCA1和ABCG1的表达情况、miR-146a对泡沫细胞的影响。结果显示，miR-146a inhibitor转染组较对照组和miR-146a mimic转染组ABCA1和ABCG1表达增高，泡沫细胞形成数目也较少。该结果证实了miR-146a与巨噬细胞泡沫化成正相关。同时miR-146a能抑制ABCA1和ABCG1的表达，阻碍胆固醇的逆行转运，最终导致动脉粥样硬化的形成。因此，我们认为miR-146a能够通过抑制CEH表达进而减少巨噬细胞胆固醇外流相关受体的表达，促进了巨噬细胞向泡沫细胞的转化。

综上所述，本研究证明了miR-146a抑制大鼠外周血单核巨噬细胞CEH的表达，促进了的细胞的泡沫化，并且降低了细胞内游离胆固醇外流。但是其机制还需要进一步的探究。同时以上研究结果的发现为进一步探讨miR-146a与CEH相关作用机制和防治AS的药理研究提供了理论依据。

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Mechanism in regulation of miR-146a promoting atherosclerotic p laque formation

MENG Fan-lei, WANG Chao, HUO X iao-chuan, GUAN Ning, LUO Jun-sheng
The frst aff liated hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Corresponding author: LUO Jun-sheng． Email: luojunshengljs@sina．com

ObjectiveTo study the effect and mechanism of miR-146a in atherosclerotic plaque．MethodsRat monocyte macrophages were transfected with agom ir-146a (miR-146a m im ic) and antagomir-146a (miR-146a inhibitor), and exposed to ox-LDL after transfection． Macrophages were stained with oil red O and sem i-quantitative analysis were used to evaluate the effect of miR-146a on lipid accumulation． Western blot was employed to detect the expression of CEH, ABCA1 and ABCG1．ResultsWestern Blot showed that the expression of CEH signif cantly decreased in miR-146a mimics, while the expression of ABCA1 and ABCG1 in miR-146a inhibitor transfection group increased much more than they were in the control group and miR-146a m im ic transfection group． Oil Red O staining showed that the positive cells ratios in miR-146a m im ic transfection group and control group and miR-146a inhibitor transfected group were 82．1%±3．1%, 73．2%±0．162% and 16．25%±2．1% respectively．ConclusionmiR-146a can inhibit the expression of CEH in rat peripheral blood mononuclear cells and hinder cholesterol effux, thus resulting in atherosclerotic plaque formation．

foam cell; cholesteryl ester hydrolase; ABCA1; ABCG1; MicroRNA

R 543.5

A

2095-5227(2014)08-0847-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.020

2014-04-04 11:40

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140404.1140.003.html

2013-11-25

国家自然科学基金项目(81171111)；辽宁省科技厅自然科学基金项目(2013022016)；辽宁省教育厅科学研究项目(L20122 98)；辽宁医学院校长基金项目(XZJJ20130211)；辽宁省科技厅科学技术计划项目(2011225055)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171111); Natural Science Foundation of Liaoning Science and Technology Committee (2013022016); Science and Technology Research Project of Liaoning Education Committee(L2012298); Science and Technology Plan Project of Liaoning Science and Technology Committee(2011225055)

孟凡磊，男，在读硕士。研究方向：脑血管病的基础与临床。Email: 791031025@qq.com

罗俊生，男，博士，出站博士后，教授，博士生导师。Email: luojunshengljs@sina.com