PTEN基因表达与食管鳞状细胞癌浸润转移的关系

潘 飞，尹 航

解放军总医院，北京 100853 1肿瘤中心实验室；2肿瘤内二科

基础研究

PTEN基因表达与食管鳞状细胞癌浸润转移的关系

潘 飞1，尹 航2

解放军总医院，北京 1008531肿瘤中心实验室；2肿瘤内二科

目的探讨食管鳞状细胞癌中的PTEN蛋白表达与食管鳞癌分化、浸润和转移的关系。方法应用免疫组化SP方法检测PTEN蛋白在50例患者的食管鳞癌组织和其匹配的癌旁组织中的表达，并用细胞迁移和侵袭实验证明PTEN对食管癌转移的作用。结果PTEN蛋白在食管鳞癌中的阳性表达率为60%，癌旁正常组织的阳性表达率为90%，差异有统计学意义(Z=4.078，P＜0.001)。PTEN的表达与肿瘤分化程度呈正相关，与淋巴结转移、浸润深度、肿瘤分期呈负相关。过表达PTEN抑制了食管鳞癌细胞的迁移、侵袭能力。结论PTEN蛋白的表达下调与食管鳞状细胞癌的浸润转移相关。

食管鳞状细胞癌；PTEN；转移

食管癌是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一。在世界范围内，发病率居全部肿瘤第8位，肿瘤相关死亡居率居第6位[1-3]。中国是食管癌高发区，组织学上以食管鳞癌为主。肿瘤转移和复发是食管癌预后差的主要原因之一，5年生存率为5% ～ 45%[4-7]。其发病机制可能与原癌基因激活、抑癌基因失活及肿瘤转移基因异常有关[8]。PTEN是10号染色体缺失且与张力蛋白同源物的抑癌基因，具有磷酸酶活性，与肿瘤的浸润、转移和预后相关[9-14]。多项研究报道PTEN基因的突变或缺失参与肿瘤的发生和发展，影响细胞周期和凋亡，甚至诱导肿瘤细胞的放疗抵抗性[15-18]。本研究采用免疫组织化学SP法检测50例患者的食管鳞癌组织和其匹配的癌旁组织中的PTEN蛋白的表达水平，探讨PTEN表达水平与食管鳞癌临床病理特征的关系，并从肿瘤细胞水平验证PTEN对食管鳞癌的功能，以期为临床治疗提供新的证据与思路。

材料和方法

1 样本来源 50例食管鳞状细胞癌(ESCC)组织标本为本院2012年3月- 2013年10月手术切除的组织标本。所有标本均取自首次切除食管且术前未接受放疗和化疗的食管癌患者。每例标本均取原发灶癌组织及距离癌组织1.5 cm以上的食管癌旁组织。所有标本均在肿瘤切除后30 min内采集，均以10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋，制备成3 μm切片。每例常规制片3张，1张HE染色进行组织学诊断和分类，2张做免疫组化染色。患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、是否转移、TNM分期等临床特征见表1。

表1 PTEN表达与食管鳞癌临床病理特征的关系Tab.1 Relationship between PTEN exp ression and clinicopathological characteristics in ESCC

2 试剂与仪器 兔抗人PTEN抗体购自Cell Signaling。SP试剂盒及浓缩型DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物有限公司。

3 免疫组化方法及结果判断 免疫组化SP方法。实验步骤按试剂盒说明书进行。采用已知的食管鳞癌阳性标本作阳性对照，用PBS液代替一抗作阴性对照。综合考虑切片中阳性细胞百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量积分法判断结果。根据显色程度判断阳性强度：基本不着色者为0分，着色淡黄色者为1分，棕黄色者为2分，棕褐色者为3分。在光学显微镜下随机选取切片并平展、选取细胞形态和组织结构清晰的视野，选取5个视野(×40)，每个视野计数100个细胞，计算各个视野中阳性细胞的平均百分率作为该切片阳性细胞的百分率。按阳性细胞的平均百分率计分：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞11% ～ 50%，3分为阳性细胞51% ～75%，4分为阳性细胞＞75%。染色强度与阳性细胞计分乘积0 ～ 2分记为(-)，3 ～ 5分记为(+)，6 ～9分记为(++)，10 ～ 12分记为(+++)。

4 细胞系与细胞培养 人食管鳞癌细胞株KYSE150由本院消化科实验室郭明洲教授惠赠。培养基为RPMI1640，血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone公司。细胞在37℃、5% CO2培养箱中进行体外培养。2 ～ 3 d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

5 质粒构建与转染 利用载体pcDNA3.1(+) (Invitrogen)和酶切位点KpnⅠ、XhoⅡ构建PTEN过表达质粒，命名为pcDNA-PTEN，对照组为pcDNA3.1。将质粒瞬转入食管鳞癌细胞株KYSE150，收集RNA和蛋白，并用Real-Time Quantitative PCR (qPCR)和Western blot来验证PTEN的过表达。转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen)。

6 Transwell迁移及细胞侵袭实验检测过表达PTEN对食管癌转移的抑制作用 无菌镊子将Transwell小室(或铺基质胶的小室)放入24孔板的孔中；将预热的无血清培养基200 μl加入到小室的上层，室温下放置20 ～ 30 min，使ECM层充分水化；用无血清培养基制备细胞悬液，浓度为5×106/ml；向24孔板中加入500 μl含20%胎牛血清的1640培养基；向每个小室中加入200 μl第3步制备的细胞悬液；孵箱中孵育24 ～ 72 h；用棉拭子将小室上层未侵袭的细胞轻轻擦掉；将500 μl结晶紫染色液加入24孔板未占用的孔中；然后将擦去上层细胞的小室放入染色液中，使其被染色液浸透，染色20 min；将小室浸入盛有去离子水的烧杯中，冲洗数次，空气干燥；显微镜下观察照相，10倍镜视野下随机选取5个视野计数细胞。

7 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件分析数据。组间差异分析采用配对设计的秩和检验，相关性分析采用Pearson χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 食管鳞癌组织标本PTEN蛋白表达低于癌旁食管组织 50例食管鳞癌组织标本的PTEN蛋白阳性率为60%，癌旁组织的阳性率为90%，差异有统计学意义(Z=4.078，P＜0.001)。见表2。

表2 PTEN在食管鳞癌和癌旁组表达情况Tab. 2 Expression of PTEN in ESCC tissues and adjacent noncancerous tissues (n)

2 食管鳞癌PTEN蛋白表达与临床病理特征的关系 PTEN蛋白在高、中、低分化食管鳞癌中的阳性表达率分别为80%(16/20)、56.3%(9/16)、35.7%(5/14)，可知食管鳞癌组织的PTEN蛋白表达水平与食管鳞癌的分化程度呈正相关，分化程度越高阳性率越高(P=0.032)。PTEN在淋巴结无转移和转移的癌组织中阳性表达率分别为78.9%(15/19)、48.4%(15/31)，两组差异有统计学意义(P=0.032)。PTEN蛋白在食管鳞癌浸润浅层组、浸润深层组阳性率分别为77.3%(17/22)、46.4%(13/28)，两组差异有统计学意义(P=0.027)。PTEN蛋白在食管癌早期表达高于晚期(P=0.021)。另PTEN蛋白表达水平与年龄、性别无相关性。见表1。

3 食管鳞癌PTEN蛋白的过表达抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力 我们构建了PTEN的过表达质粒。将质粒瞬转入食管鳞癌细胞株KYSE150，48 h后收集RNA和蛋白，通过qPCR和Western blot检测，结果表明PTEN在KYSE150细胞中实现了过表达(图1)。Tanswell迁移实验显示PTEN过表达组(pcDNA-PTEN)癌细胞迁移穿过小孔的数目比对照组(pcDNA3.1)少了近60%(图2A)，过表达PTEN抑制了癌细胞的迁移能力(P＜0.05)。细胞侵袭实验结果表明PTEN过表达组(pcDNAPTEN)癌细胞穿过小孔的数目比对照组(pcDNA3.1)少了近65%(图2B)，过表达PTEN抑制了癌细胞的侵袭能力(P＜0.05)。

图 1 成功构建PTEN过表达质粒Fig. 1 Overexpression of PTEN was successfully constructed

图 2 PTEN的高表达可以抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭能力 A： 迁移实验； B： 侵袭实验Fig. 2 Overexpression of PTEN rem arkably inh ibited the ability of m igration (A) and invasion (B) in ESCC cells (a P＜0.05, b P＜0.05)

讨 论

PTEN基因是1997年发现的抑癌基因，位于染色体10q23上，全长210 kb，编码含403个氨基酸的蛋白质[19]。PTEN具有特异的磷酸酶活性，可调节3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)和3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水平，影响Akt通路，从而调控细胞的增殖分化和凋亡，发挥肿瘤抑制作用[20]。也有研究证明，PTEN通过下调局灶黏附激酶的表达，抑制胃癌的转移和浸润[12]。

PTEN广泛表达于上皮细胞，主要通过基因的突变、缺失或甲基化而失活，表现为PTEN mRNA或蛋白的不表达或表达下调[21-22]。食管鳞癌是上皮来源的肿瘤。本研究结果显示食管鳞癌组织中的PTEN蛋白阳性表达率低于相应的癌旁组织。这表明抑癌基因PTEN的表达下调在食管癌的发生、发展过程中具有重要的作用。我们进一步探讨了PTEN的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系，发现：1)PTEN蛋白表达水平与食管鳞癌分化程度呈正相关，分化程度越低，肿瘤恶性程度越高，阳性率越低；2)PTEN蛋白表达水平与淋巴结是否转移有关，无淋巴结转移组的阳性表达率高于淋巴结转移组；3)PTEN蛋白表达水平与食管鳞癌浸润程度呈负相关，浸润深层组PTEN阳性率低于浸润浅层组；4)PTEN蛋白表达水平与临床TNM分期呈负相关，Ⅰ～Ⅱ期的PTEN阳性率高于Ⅲ～Ⅳ期的阳性率，提示PTEN的表达缺失或下调主要发生在食管鳞癌的晚期。

以上结果表明，PTEN蛋白表达与食管鳞癌的恶性程度、浸润深度、转移能力相关，这与PTEN在其他肿瘤中的作用相似[16-17]。为此，我们通过细胞水平上的迁移和侵袭实验证明PTEN过表达组的癌细胞穿过小孔的数目均少于对照组，提示PTEN的高表达可以抑制细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，PTEN蛋白在食管鳞癌的发生、发展中起到了重要作用，可以调控食管鳞癌的浸润、转移。对食管癌的PTEN基因研究，有助于进一步阐明食管癌的发生机制，为肿瘤的诊断、治疗、预后评估提供新的思路。

1 Ferlay J， Shin HR， Bray F，et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008： GLOBOCAN 2008［J］. Int J Cancer， 2010， 127（12）： 2893-2917.

2 Komatsu S， Ichikawa D， Takeshita H，et al. Prognostic impact of circulating miR-21 and miR-375 in p lasma of patients with esophageal squamous cell carcinoma［J］. Expert Opin Biol Ther，2012， 12（1）： S53-S59.

3 Zhu YH， Fu L， Chen LL，et al. Downregulation of the novel tumor suppressor DIRAS1 predicts poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Cancer Res， 2013， 73（7）： 2298-2309.

4 Chen FJ， Sun M， Li SQ，et al. Upregulation of the long Non-Coding RNA HOTAIR promotes esophageal squamous cell carcinoma metastasis and poor prognosis［J］. Mol Carcinog， 2013， 52（11）：908-915.

5 Lv XB， Lian GY， Wang HR，et al. Long noncoding RNA HOTAIR is a prognostic marker for esophageal squamous cell carcinoma progression and survival［J］. PLoS One， 2013， 8（5）：e63516.

6 Sato F， Shimada Y， Watanabe G，et al. Expression of vascular endothelial growth factor， matrix metalloproteinase-9 and E-cadherin in the process of lymph node metastasis in oesophageal cancer［J］. Br J Cancer， 1999， 80（9）： 1366-1372.

7 Thompson SK， Ruszkiewicz AR， Jamieson GG，et al. Improving the accuracy of TNM staging in esophageal cancer： a pathological review of resected specimens［J］. Ann Surg Oncol， 2008， 15（12）：3447-3458.

8 Denlinger CE， Thompson RK. Molecular basis of esophageal cancer development and progression［J］. Surg Clin North Am， 2012， 92（5）：1089-1103.

9 Cai JC， Fang LS， Huang YB，et al. miR-205 targets PTEN and PHLPP2 to augment AKT signaling and drive malignant phenotypes in Non-Small cell lung cancer［J］. Cancer Res， 2013， 73（17）：5402-5415.

10 Chowdhury S， Ongchin M， Wan G，et al. Restoration of PTEN activity decreases metastases in an orthotopic model of colon cancer［J］. J Surg Res， 2013， 184（2）： 755-760.

11 Leinonen KA， Saramäki OR， Furusato B，et al. Loss of PTEN is associated with aggressive behavior in ERG-positive prostate cancer［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2013， 22（12）： 2333-2344.

12 Zhang LL， Liu J， Lei S，et al. PTEN inhibits the invasion and metastasis of gastric cancer via downregulation of FAK expression［J］. Cell Signal， 2014， 26（5）： 1011-1020.

13 Chen J， Li T， Liu Q，et al. Clinical and prognostic significance of HIF-1α， PTEN， CD44v6， and survivin for gastric cancer： a metaanalysis［J］. PLoS One， 2014， 9（3）：e91842.

14 Cordes I， Kluth M， Zygis D，et al. PTEN deletions are related to disease progression and unfavourable prognosis in early bladder cancer［J］. Histopathology， 2013， 63（5）： 670-677.

15 Dean SJ， Perks CM， Holly JM，et al. Loss of PTEN expression is associated with IGFBP2 expression， younger age， and late stage in triple-negative breast cancer［J］. Am J Clin Pathol， 2014， 141（3）：323-333.

16 Squarize CH， Castilho RM， Abrahao AC，et al. PTEN deficiency contributes to the development and progression of head and neck cancer［J］. Neoplasia， 2013， 15（5）： 461-471.

17 Xu WT， Yang Z， Lu NH. Roles of PTEN （phosphatase and tensin homolog） in gastric cancer development and progression［J］. Asian Pac J Cancer Prev， 2014， 15（1）： 17-24.

18 Qu C， Liang Z， Huang J，et al. MiR-205 determines the radioresistance of human nasopharyngeal carcinoma by directly targeting PTEN［J］. Cell Cycle， 2012， 11（4）： 785-796.

19 Stocker H， Andjelkovic M， Oldham S，et al. Living with lethal PIP3 levels： viability of flies lacking PTEN restored by a PH domain mutation in Akt/PKB［J］. Science， 2002， 295（5562）： 2088-2091.

20 Li J， Yen C， Liaw D，et al. PTEN， a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain， breast， and prostate cancer［J］. Science， 1997， 275（538）： 1943-1947.

21 Frisk T， Foukakis T， Dwight T，et al. Silencing of the PTEN tumor-suppressor gene in anaplastic thyroid cancer［J］. Genes Chromosomes Cancer， 2002， 35（1）： 74-80.

22 Latta E， Chapman WB. PTEN mutations and evolving concepts in endometrial neoplasia［J］. Curr Opin Obstet Gynecol， 2002， 14（1）：59-65.

Relationship between expression of PTEN and infiltration and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma

PAN Fei1, YIN Hang2
1Key Laboratory of Oncology;2Department of Oncology Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
The frst author: PAN Fei． Email: panfeisysu@126．com; YIN Hang． Email: story2001@126．com

ObjectiveTo investigate the relationship between protein expression of PTEN and differentiation, infiltration and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma (ESCC)．MethodsThe immunohistochem isty SP method was used to detect the protein expression of PTEN in 50 cases of ESCC tissues and adjacent noncancerous tissues． Then, cell biological experiments such as migration and invasion experiments were performed in ESCC cell lines to explore their functions in tumor progression．ResultsThe positive incidence of PTEN in ESCC tissues was 60%, while in adjacent noncancerous tissues, it was 90%． The differences were statistically signif cant (Z=4．078, P＜0．001)． The protein expression of PTEN was positively correlated with its differentiation．Furthermore, the protein expression of PTEN had a negative correlation with lymph node metastasis，depth of invasion and TNM．Correspondingly, overexpression of PTEN remarkably inhibited the ability of m igration and invasion in ESCC cells．ConclusionThe decreased protein expression of PTEN plays an important role in the metastasis of ESCC．

esophageal squamous cell carcinoma; PTEN; metastasis

R 735.1

A

2095-5227(2014)08-0843-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.019

2014-06-05 10:35

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140605.1035.002.html

2014-05-05

国家自然科学基金项目(81301781)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81301781)

潘飞，男，在读硕士。研究方向：消化系统肿瘤。Email: panfeisysu@126.com；共同第一作者：尹航，男，主治医师。研究方向：肺癌和消化系统肿瘤。Email: story2001@126.com