针刺人中穴对MCAO大鼠中枢神经系统神经干细胞增殖影响的研究*

罗 丁，樊小农，赵海英，齐兆双，石学敏

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津 300193；3.国家中医药管理局量效关系三级实验室，天津 300193；4.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室，天津300193；5.天津市针灸学重点实验室，天津 300193）

·实验研究·

针刺人中穴对MCAO大鼠中枢神经系统神经干细胞增殖影响的研究*

罗 丁1，樊小农2，3，4，赵海英1，齐兆双1，石学敏2，5

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中医药大学第一附属医院针灸研究所，天津 300193；3.国家中医药管理局量效关系三级实验室，天津 300193；4.国家中医药管理局脑病针刺疗法重点研究室，天津300193；5.天津市针灸学重点实验室，天津 300193）

[目的]探讨针刺人中穴治疗缺血性脑卒中的神经发生机制。[方法]用BrdU+/nestin+免疫荧光双标和蛋白免疫印迹法观察针刺对线栓法大鼠大脑中动脉阻断实验模型（MCAO）大鼠大脑新生神经细胞及皮质、海马、纹状体nestin蛋白表达量的变化的影响。[结果]针刺组MCAO大鼠BdrU+、nestin+和BrdU+/nestin+细胞数均高于正常组、假手术组和模型组（P＜0.05），模型组高于正常组和假手术组（P＜0.05）；针刺组nestin在海马和皮质的表达量高于其他组别（P＜0.05）。[结论]缺血缺氧能引起MCAO大鼠脑神经干细胞的增殖，而针刺人中穴能增强神经干细胞增殖作用，促进大脑功能的修复。

人中穴；MCAO；神经干细胞；BrdU；nestin

在中国脑卒中是导致成年人致死致残的主要因素，流行病学研究表明其病死率高达157个人/ 10万，每年新发患者约250万，有男性高于女性（1.3~ 1.5∶1）、缺血性高于出血性卒中（43%~79%∶18%~ 47%）的趋势，给家庭和社会经济带来沉重负担[1]。治疗脑卒中的首要目标是提高患者的生存率和生活质量，而传统观点认为神经细胞是永久细胞，脑卒中时神经细胞损伤为不可逆损伤。石学敏院士创立的醒脑开窍针刺法对卒中后患者神经功能恢复有很好的效果，但脑内机制尚不明确，因此本研究以针刺人中穴（醒脑开窍针刺法主穴）为切入点，用BrdU/ nestin荧光双标和蛋白免疫印迹的方法，观察大鼠大脑中动脉阻断实验模型（MCAO）新生神经细胞及鼠脑皮质、海马、纹状体nestin蛋白表达量变化，探讨针刺治疗缺血性脑卒中的神经发生机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 水合氯醛、无水乙醇、二甲苯、浓盐酸（天津化学试剂厂），4%多聚甲醛溶液（武汉博士德公司），石蜡（上海华永公司），BrdU（Sigma公司），兔抗大鼠Nestin多克隆抗体（Abcom公司），小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体（Millipore Chemicon公司），山羊抗小鼠IgG绿色荧光二抗、山羊抗兔IgG红色荧光二抗山羊封闭血清工作（上海麦约尔公司），多聚赖氨酸防脱片（北京中杉金桥公司），Bis、Tris、APS、SDS、EDTA、NP-40，Tritonx-100、PMSF、TEMED、异丙醇、BCA kit、GelBlotPapers杂交滤纸，溴酚蓝，BCA蛋白定量试剂盒，裂解液，甘油，β-巯基乙醇，PVDF膜（均购于上海生工）。marker(10-250kDa，Fermentas，#SM1811)，显影液，内参（βactin）二抗（羊抗兔），Nestin山羊抗小鼠HRP标记抗体均购自MILLPORE公司，内参（β-actin）一抗（ 兔 抗 鼠 ，CellSignaling，#4970），Anti-Nestin Monoclonal Antibody购自Thermo公司。

1.1.2 主要仪器 LEICATP1200脱水机、LEICAEG1150H包埋机、LEICAEG1150C冰台、LEICARM2245切片机、荧光显微镜（德国LEICA）；CS-VI型摊片烤片机、TS-1型脱色摇床、HH-W三用恒温水箱、BT-100恒流泵，电泳仪、转膜槽（北京六一厂），BioRad凝胶成像系统（BioRad公司），移液器（Eppendorf），Olympus数码相机（以上均由天津中医药大学第一附属医院针灸研究所提供）。

1.2 实验动物与分组 SPF级Wistar成年健康雄性大鼠40只（260~280 g，军事医学科学院），按随机数字表分为正常组、假手术组、模型组和针刺组（n=10）。实验操作获天津中医药大学动物伦理委员会批准，所有动物均遵循相关规定进行处理。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备与干预方法 参照Zea-Longa线栓法制备大鼠MCAO模型[2]，大鼠造模清醒后，按Zausinger[3]六分法评定造模成功与否，排除造模后病情过轻或过重的模型（评分为0、4和5分的大鼠）。针刺组大鼠在造模成功清醒后，予针刺人中穴（大鼠鼻中隔下方约1 mm[4]）干预，刺激参数为频率180次/分，持续刺激5 s，每12 h一次，持续7 d。假手术组：除不插入鱼线外操作与手术组相同，并与针刺组相同次数捉抓。

1.3.2 标本取材与制备 每组10只大鼠中，5只用于荧光双标记、5只用于免疫沉淀检测大脑海马、皮质和纹状体各部nestin蛋白含量。用于检测荧光双标记的大鼠于造模24 h后腹腔注射给予BrdU（50 mg/kg），每12 h一次，连续6 d，7 d后4%多聚甲醛灌注取脑固定，24 h后在大脑冠状位视交叉处切厚约3 mm脑组织切片，依次置于70%、80%、90%、95%、100%乙醇和二甲苯、石蜡中脱水，包埋机中包埋后切成4μm片，用多聚赖氨酸处理的防脱片捞起置于60℃烘片机上烘干备用。用于免疫蛋白质印迹法检测的大鼠断头后取脑冷冻备用。

1.3.3 免疫荧光双标记法 70℃烤片2 h，用二甲苯和梯度乙醇脱蜡透明水化组织切片，0.01 mmol/L PBS冲洗3次，柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）微波炉中火5 min两次进行抗原修复，室温下冷却60 min，0.01 mol/L PBS冲洗3次后在2 mol/L HCl 37℃中解旋30 min，PBS漂洗后用10%山羊血清室温封闭30min，加Brdu 1∶50、Nestin 1∶100一抗混合液4℃孵育过夜，室温复温45 min后加山羊抗小鼠（1∶300）、山羊抗兔（1∶300）避光孵育4 h，75%甘油封片，荧光显微镜观察拍摄，记录400倍下每个视野中阳性细胞的数量。

1.3.4 免疫蛋白质印迹法 用蛋白酶抑制剂和裂解液（1:50）提取各组海马、皮质、纹状体的总蛋白，分装于-80℃冰箱中保存，用BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量，定量后的蛋白样品分别经8%和10%聚丙烯酰胺凝胶（均用丙烯酰胺、tris、SDS、APS、TEMED制备）20 mA电泳。在传膜槽中转膜，将转膜后的PVDF膜放入5%牛奶封闭液中封闭1 h，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗3次后加3 mL一抗小鼠抗大鼠（1∶3 000）密封4℃过夜，漂洗后加二抗羊抗鼠HRP（1∶4 000）室温中摇动反应,加化学发光检测试剂，用Biorad凝胶成像系统显影。

1.4 统计方法 用SPSS18.0软件包对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布计量资料的组间比较采用单因素方差分析，偏态分布计量资料的组间比较采用Wilcoxon秩和检验，检验水准α=0.05。

2 实验结果

2.1 针刺对神经干细胞增殖的影响 免疫荧光双标记法观察各组大鼠脑片，正常组和假手术未见免疫阳性细胞，模型组和针刺组可见免疫阳性细胞，主要分布于缺血皮质及纹状体、半暗带周围，其中针刺组阳性细胞数高于模型组，表明缺血缺氧能诱导神经干细胞增殖，而针刺人中穴能增强缺血缺氧后神经干细胞增殖作用（见表1、图1）。

表1 针刺对神经干细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 个/视野

表1 针刺对神经干细胞增殖的影响（±s）Tab.1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells（±s） 个/视野

注：与正常组相比，*P＜0.05；与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组相比，○P＜0.05；与针刺组相比，☆P＜0.05。

组别 n BrdU+nestin+BrdU+/nestin+正常组 5 0○☆0○☆0假手术组5 0○☆0○☆0模型组 5 8.80±1.30*#☆4.60±0.89*#☆0针刺组 5 26.20±6.76*#○10.40±1.14*#○2

2.2 针刺对大鼠海马、皮质、纹状体nestin蛋白表达的影响 7 d后，模型组、针刺组大鼠海马、皮质的nestin表达蛋白均增加（P＜0.05），纹状体虽无统计学意义，但也表现出了增加的趋势，说明缺血能诱导大脑nestin蛋白的表达，而针刺能增强nestin蛋白的表达（见表2）。

表2 针刺对大鼠海马、皮质、纹状体nestin蛋白表达的影响（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

表2 针刺对大鼠海马、皮质、纹状体nestin蛋白表达的影响（±s）Tab.2 Effects of acupuncture on the expression of nestin protein in cortex,hippocampus and striatum（±s）bit

注：与正常组相比，*P＜0.05；与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组相比，○P＜0.05；与针刺组相比，☆P＜0.05。

组别 n 海马 皮质 纹状体正常组 5 01.62±0.58 1.56±0.55 1.39±0.29假手术组 5 01.44±0.87 1.81±1.09 1.34±0.47模型组 5 07.32±12.92*#☆2.75±1.36*#2.07±2.25针刺组 5 15.61±23.50*#○4.67±1.20*#2.84±2.19

图1 针刺对神经干细胞增殖的影响Fig 1 Effect of acupuncture on the proliferation of neural stem cells

3 讨论

神经干细胞是存在于成年哺乳动物中枢神经系统内、具有增殖和分化功能的一类细胞[5]，缺血性脑卒中能诱发脑内神经干细胞的增殖、分化与转移[6-7]，从而实现大脑的自我修复，减少缺血缺氧造成的损害，使治疗脑卒中后神经功能损伤成为可能。研究表明，神经干细胞在正常鼠脑中主要以静息的状态存在于室管膜下层（SVZ）[8]和海马齿状回区（DG）[9]，这些内源性的NSCs在一定条件下如缺血缺氧、外伤等，可被激活、并分化为神经细胞和胶质细胞，参与新神经功能环路形成，从而促进神经功能的恢复。

BrdU是胸腺嘧啶脱氧核苷的类似物，因其能在S期进入细胞核内参与细胞分裂多用于标记包括神经细胞、少突神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等在内的各种新生细胞。nestin是在广泛存在于胚胎期神经细胞中、并在哺乳动物中枢神经神经系统发育过程中一过性表达的特异性第Ⅵ类中间丝蛋白，是神经细胞的标志性抗原，多用于监测神经干细胞的增殖情况。

醒脑开窍针刺法是经过几十年临床应用、已证明了的对缺血性脑卒中患者神经功能与生活质量有较好疗效的治疗方案[10]。笔者的前期研究表明，醒脑开窍针刺法能通过上调c-fos[11]和CaN[12]基因的表达，建立脑梗死后的侧枝循环[13]，抑制海马神经元细胞Ca2+[14]超载，改善局部微循环[15]和维持缺血后正常神经细胞数量[16-17]，从而实现MCAO大鼠行为学、梗死率等指标的改善[18]。本研究中，通过对神经干细胞数量和MCAO鼠大脑海马、皮质、纹状体的nestin蛋白表达量的观察，发现经MCAO造模后的模型组、针刺组无论在BrdU+、nestin+，还是nestin蛋白表达量上，均高于正常组和假手术组（P＜0.05），表明大脑中动脉阻塞造成的缺血缺氧可诱导成年鼠大脑中的NSCs的增殖，这与国内外学者的研究结果[6,19-21]一致，而针刺组上述指标的表达又高于正常组、假手术组和模型组（P＜0.05），表明针刺人中穴能促进缺血皮质及海马、半暗带周围NSCs的增殖，增殖的胶质细胞或神经细胞对MCAO后神经发生有正性调节的作用。故醒脑开窍针刺法治疗缺血性脑卒中获效的机制可能与人中穴促进神经干细胞增殖、分化和成活，以维持正常“工作”的神经元数量有关。

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Study on the effect of acupuncturing Renzhong on proliferation of neural stem cells in central nervous system of MCAO rat

LUO Ding1,FAN Xiao-nong2,3,4,ZHAO Hai-ying1,QI Zhao-shuang1,SHI Xue-min2,5
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The Acupuncture and Moxibustion Institute of the First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;3.Three-level Laboratory of dose-effect relationship of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;4.Tianjin Acupuncture Key Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China;5.Acupuncture Encephalopathy Key Research Laboratory of the State Administration of TCM,Tianjin 300193,China）

[Objective]To discuss the mechanism of treating ischemic stroke by acupuncturing Renzhong.[Methods]We observed the population of BrdU+/nestin+cells and expression of nestin protein in cortex,hippocampal and striatum in MCAO rat by double-labeling immunofluorescence and Western blot.[Results]Renzhong group’s population of BdrU+,nestin+and BrdU+/nestin+cells were significant higher than that in normal group,sham group and control group in brain of MCAO rat（P＜0.05）.Renzhong group also had the highest expression of nestin protein in cortex and hippocampal（P＜0.05）.[Conclusion]Acupuncture of Renzhong can enhance the proliferation of NSCs in central nervous system of MCAO rat.

Renzhong；MCAO；NSCs；BrdU；nestin

R223.11

A

1672-1519（2014）09-0548-04

2014-03-18）

（本文编辑：马 英，张震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.12

国家重点研究计划（973）项目（2010CB530506）；天津市科委项目（10JCBJC12700）。

罗 丁（1985-），女，博士研究生，研究方向为针刺治疗脑卒中的机制研究。

樊小农，E-mail：fanxiaonong@163.com。