中药灌肠对5/6肾切除大鼠肾衰竭模型微炎症状态的影响*

姜 晨，王佳丽，宫欣茹，张 琳，翟建新，杨洪涛

（天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

中药灌肠对5/6肾切除大鼠肾衰竭模型微炎症状态的影响*

姜 晨1，王佳丽2，宫欣茹1，张 琳1，翟建新1，杨洪涛1

（天津中医药大学第一附属医院肾病科，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]观察中药灌肠改善慢肾衰模型大鼠的微炎症状态情况，探讨其机制。[方法]将44只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、灌肠方组和辛伐他汀组，除正除对照组外均行5/6肾切除术制作CRF动物模型。造模后各组开始灌胃或灌肠给药6周。分别于造模后1、3、6周取血检测大鼠的血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Toll样受4（TLR4）等变化情况。实验结束后观察肾脏和小肠组织形态学的改变。[结果]灌肠方组大鼠的微炎症指标CRP、TNF-α浓度与辛伐他汀组没有统计学差异，说明灌肠方在改善微炎症状态中也有类似于他汀类药物的作用，其机制可能与阻断TLR4表达有关。肾脏病理结果显示灌肠治疗对肾间质纤维化有一定的改善作用。[结论]中药灌肠能改善CRF大鼠生存状态，延缓病情进展，对肾间质纤维化有一定的积极作用。其作用机制可能是通过降低炎症因子表达，改善微炎症状态有关，其作用与辛伐他汀类似。

5/6肾切除；慢肾衰；微炎症状态；中药灌肠；辛伐他汀

“微炎症状态”在慢性肾功能衰竭（CRF）进程中十分普遍，这种以炎症因子、急性反应蛋白轻度持续升高为特点的微炎症状态可加重CRF患者肾功能恶化程度，而且促进动脉粥样硬化（AS）、营养不良、贫血等并发症的发生，影响患者死亡率及临床预后[1-2]。在针对微炎症状态的中医治疗中，灌肠疗法及中药汤剂的运用发挥了多靶点治疗的突出作用，已有研究证明[3]中药能改善CKD炎症反应，其机制可能与调节脂质代谢和改善细胞免疫功能有关。天津中医药大学第一附属医院肾病科开展结肠透析并运用灌肠方中高位保留治疗慢性肾衰竭，能有效改善尿毒症患者的临床症状，延缓肾功能损害的进程。为证实该法对“微炎症状态”的干预作用，笔者通过5/6肾切除大鼠肾衰竭模型，评价中药灌肠在改善CRF大鼠“微炎症状态”方面的作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级雄性大鼠，体质量（200± 20）g。购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.2 药物 灌肠方中药物（大黄30 g，蒲公英30 g，生牡蛎30 g）购自天津中医药大学第一附属医院中药房，由天津中医药大学第一附属医院煎药室制备。辛伐他汀片：杭州默沙东制药有限公司，批号130168。

1.3 仪器与试剂 BAll0S型电子天平（德国Sartorius公司）、TGL－16G低温台式离心机（北京医用离心机厂制造）、全自动生化分析仪（日本日立70209全自动生化分析仪）、Elisa的仪器：（450±10）nm滤光片的酶标仪、单道或多道微量加液器及吸头、稀释样品的EP管等。C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、Toll样受体4（TLR4）试剂盒：购自武汉优尔生科技股份公司。血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、TG试剂盒均购自北京中生北控生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分组 CRF大鼠于造模成功后随机分为3组：1）模型组。2）灌肠方组。3）辛伐他汀组，每组12只。4）正常对照组（即假手术组）8只。

2.2 造模 大鼠适应性喂养3天后，依据Platt法即5/6肾切除术并按照最新的文献记载[4]制备CRF大鼠模型。各组大鼠均以10%水合氯醛麻醉，常规消毒术后做背部正中直行切口，使用大鼠开口器以暴露背阔肌及腹外斜肌显现腰下三角，经此三角向上切开背阔肌，向下切开腹外斜肌，并于腰上三角处切开腰背筋膜，拉开切口，充分暴露左肾。除假手术组外，其余各组均切除左肾上下两极约2/3，明胶海绵止血后，复位肾脏，缝合。1周后性第2次手术，结扎肾蒂，切除右肾。待创面凝固后，切口处放入少量磺胺粉，分别用0号、4号丝线逐层间断缝合。术后常规注射青霉素（80 kU/只）×3 d。分别于手术后第1、3周取血测定各造模组大鼠SCr、BUN水平，以SCr水平显著高于正常对照组为造模成功，建立CRF大鼠模型。造模前后各组大鼠SCr水平见图1。

图1 造模前后各组大鼠Scr水平Fig.1 The levels of Scr in rats of each group after model establishment

2.3 给药 从造模成功后第2周开始给药处理，1）组给予蒸馏水2 mL灌胃。2）组给予灌肠方浓煎剂2 mL，30℃左右，悬尾倒立保留灌肠1min。3）组给予辛伐他汀[5]生药2 mL灌胃。上述各组灌药1次/天，连续给药6周。正常对照组不进行任何处理，以上各组均用常规饲料喂养，自由饮水中药灌肠方和辛伐他汀片的用量按照“人和动物体表面积折算的等效剂量比值表”计算，每次灌胃前新鲜配制。

2.4 取材与检验方法

2.4.1 取材 实验结束时（给药6周后）大鼠隔夜空腹，测量体重，以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定大鼠暴露腹部，剪开腹部及胸廓，心脏采血约10 mL，分别注入血清管、肝素抗凝管及EDTA血常规管。肝素抗凝管2 000 r/min离心15 min、血清管5 000 r/min离心10 min，分别收集血清及血浆，400 μL/管分装后-80℃冰箱保存，待测SCr、BUN、TG、CRP、TNF-α、TLR4等指标。提取各组肾脏和小肠的标本，经过10%福尔马林溶液固定后，石蜡包埋，做HE染色，光镜观察。

2.4.2 检测方法 采用Elisa法检测CRP、TNF-α、 TLR4的浓度变化，严格按照试剂盒的说明，SCr、BUN、TG检查应用日立公司70209全自动生化分析仪测定。

2.4.3 统计学处理 应用SPSS19．0统计分析软件对结果进行处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐则采用LSD法，若方差不齐则采用Dunnett’T3法，P＜0．05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 治疗6周后各组血肌酐、尿素氮、甘油三酯的变化 见表1。

表1 治疗后大鼠血SCr、BUN、TG情况比较（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

表1 治疗后大鼠血SCr、BUN、TG情况比较（±s）Tab.1 Comparison of blood serum SCr,BUN and TG in rats after treatment（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05；灌肠方组与辛伐他汀组比较，△P＜0.01。

组别 n SCr（μmol/L） BUN（mmol/L） TG（mmol/L）模型组 12 68．74±4．66 8．84±1．57 0．99±0．45灌肠方组 12 52．42±2．36*△8．76±1．35 0．65±0．20**辛伐他汀组 12 77．10±7．26 8．81±1．20 0．32±0．09*△

3.2 治疗6周后各组CRP、TNF-α、TLR4的浓度变化 见表2。

表2 治疗后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的浓度比较（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

表2 治疗后大鼠血清CRP、TNF-α、TLR4的浓度比较（±s）Tab.2 Comparison of the concentration of blood serum CRP, TNF-α,and TLR4 in rats after treatment（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.01，灌肠方组与辛伐他汀组比较，△△P＜0.05。

组别 n CRP（ng/mL） TNF-α（pg/mL） TLR4（ng/mL）模型组 12 12．19±1．97 30．15±0．75 12．93±1．53灌肠方组 12 08．03±0．86* 30．52±0．86 06．31±0．90*辛伐他汀组 12 07．16±1．19* 29．86±0．80 04．13±1．01*△△

3.3 各组大鼠肾脏及小肠的光镜下病理情况比较肾脏的病理结果显示模型组与辛伐他汀组普遍存在肾间质纤维化，局部小片状弥漫性炎症，并有曲管变性或肾小球变性萎缩、蛋白管型，这可能与手术切除肾组织造成的损伤及炎症反应有关。灌肠方组切片的表现轻于其他两组。其可能的机制是灌肠方打破了上述的循环，间接地减轻了肾小球内的压力，解除了引起肾小球肥大的部分因素，从而减轻了5/6肾切除大鼠的肾脏病理改变。小肠的病理切片显示绒毛水肿，固有膜炎细胞增多，模型组、中药组、西药组间没有明显的差异改变，也提示中药灌肠对肠黏膜没有损伤。

4 讨论

中国传统医学对于肾衰病的辨证论治中，“下法”是一类重要的治疗大法。根据肾衰病本虚标实，浊毒内蕴的病理性质，针对其邪实正虚的病机，泻邪法的运用必不可少，临床运用多以通腑泄浊、清热利湿为主要的具体治法，其机理就是为了加强肠腑传化功能来祛除体内浊毒之邪。高位灌肠是治疗肾衰病的外治法之一，其通过肠道的交换使浊毒之邪快速有效的排出体外，在临床上应用广泛。在针对微炎症状态的中医治疗中，灌肠疗法及中药汤剂的运用发挥了多靶点治疗的突出作用，已有研究证明[3]中药能改善CKD炎症反应，其机制可能与调节脂质代谢和改善细胞免疫功能有关。我院开展结肠透析中运用灌肠方高位保留灌肠，临床验证能有效的改善尿毒症患者的临床症状，降低血肌酐、尿毒氮的水平，延缓肾功能损害的进程。既往的药理研究[6]已发现大黄的抑菌作用尤为突出，对继发于细菌性腹膜炎的麻痹性肠梗阻有治疗作用，蒲公英、牡蛎提取液也有一定的抑菌作用，且针对金黄色葡萄球菌大黄酸联合抗生素有协同作用，故针对CRF存在的微炎症状态可通过中药灌肠降低炎症因子的表达，从而缓解患者的微炎症状态。他汀类药物在慢性肾脏病中的运用已成为近几年的研究热点，在改善微炎症和心血管事件中都存在一定的作用，能早期有效抑制炎症反应、降低炎症前因子和C-反应蛋白[7-9]，尤其是针对尿毒症透析患者中长期存在的微炎症状态，早期运用在治疗中能起到一定的协同作用[10-11]；这种抑制作用可通过下调Toll样受体4（TLR4）和核转录因子-κB（NF-κB）的表达，抑制炎症反应而实现[12-13]。

本研究观察了5/6 CRF的模型的微炎症状态情况，验证了CRF模型中微炎症指标的升高，且持续数周，能初步断定慢肾衰的一种持续的微炎症状态的存在性，这与近期的一些实验研究结果相符[1,3,14]。微炎症状态是一种仅表现为实验室指标异常而没有明显的临床症状的状态，临床中通过主要检测血清超敏CRP和ALB来判断。本实验中通过对CRP和TNF-α浓度的检测来观察微炎症的情况，血清TNF-α的浓度均较高，提示其在肾衰中高表达诱导了持续的微炎症状态，而本实验的两种药物干预未能有效的降低TNF-α的浓度值。考虑可能与药物的作用位点和靶点不同有关，可通过在基因水平上研究阻断TNF-α高浓度的因子来开展更深入的研究。TLR4在肾脏中的意义是近年来研究的一个热点问题，主要是因为它与NF-κB的表达关系密切，NF-κB是多系统疾病如心脏病、糖尿病、慢性肾脏病等的一个关键的表达因子，所以近年来成为多学科、跨领域临床与实验研究的焦点。本实验中通过Elisa方法检测了血清中TLR4的浓度水平，发现慢肾衰大鼠血清中的TLR4的浓度明显高于正常组，其可能的机制与肾衰本身有关，辛伐他汀组的TLR4浓度明显低于模型组和灌肠方组，且随着用药周期的延长能保持一个下降的趋势。灌肠方组TLR4的浓度低于模型组但高于辛伐他汀组，且至6周也有一个下降的趋势。考虑可能与辛伐他汀阻断了NF-κB的表达，进而抑制了TLR4的分泌有关。同时，病理结果也提示中药灌肠对肾间质纤维化有一定改善。

本实验结果表明中药灌肠治疗对尿毒症微炎症状态有确切干预作用，表现为抑制CRP与TLR4分泌，其作用机制可能与辛伐他汀类似，即阻断NF-κB的表达，进而抑制了TLR4的分泌。

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Effect on 5/6 nephrectomy rats with micro-inflammation state treated with TCM enema

JIANG Chen1,WANG Jia-li2,GONG Xin-ru1,ZHANG Lin1,ZHAI Jianxin1,YANG Hong-tao1
（1.Department of Nephropathy,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193, China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To observe effect to micro-inflammation state in experimental chronic renal failure(CRF)rats treated with TCM enema and explore it’s mechanism.[Methods]The 44 SD male rats were randomly divided into normal control group,model control group,enema group and simvastatin group.All rats were 5/6 nephrectomy surgery to become CRF animal models except normal control group.After model establishment,each group began to fill the stomach or enema for 6 weeks.The blood serum creatinine(SCr),blood urea nitrogen(BUN),triglyceride(TG),C reactive protein(CRP),transforming growth factor alpha(TNF-α),and toll like receptor 4(TLR4) were detected respectively at 1,3,6 weeks in each group,Animals were sacrificed at the end of the experiment to observe the morphological change of kidney and small intestine.[Results]The concentration of CRP and TNF-α were no statistical difference between enema group and simvastatin group.It suggested that the function of TCM enema was also similar to the role of statins in improving the micro-inflammatory state,and its mechanism may be related to blocking the expression of TLR4.Pathological results showed that enema group has a certain improving effect on renal interstitial fibrosis.[Conclusion]TCM enema can improve the CRF rat survival state,delay the progress of the disease,and have certain positive effect on renal interstitial fibrosis.The mechanism of action of TCM enema may relate to reducing inflammation factor expression,improve micro-inflammation state function.The function of TCM enema is similar to simvastatin.

5/6 nephrectomy;chronic renal failure;micro-inflammatory state;enema;simvastatin

R285.5

A

1672-1519（2014）09-0556-04

2014-03-09）

（本文编辑：马 英，张震之）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.09.14

国家自然科学基金青年科学基金项目（No. 81302920）。

姜 晨（1982-），女，医学博士，主治医师，长期从事中西医结合肾脏病工作。

杨洪涛，E-mail：tjtcmht@126.com。