采用Pyrosequencing和Pooling技术对SNP位点多态性分析

赵珍敏，张素华

（司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063）

SNP位点作为第三代遗传标记，由于其突变率低，在基因组中分布广泛等特点，在法医学中的应用越来越受到法医学研究者的关注。SNP位点的多态性分析是判断该位点是否纳入法医学应用的首要工作。进行多态性分析时，常采用 TaqMan、SNPstream或HRM等方法对大规模样本进行检测，对后续数据进行统计分析以判断SNP位点的多态性。这样的方法普遍成本高，耗时多，工作量大。本研究中拟采用pooling技术建立一组池，采用pyrosequencing这一短片段高精度的测序技术，对SNP位点进行等位基因定量分析，从而快速得到其多态性信息。

1 材料与方法

1.1 样本信息

50份健康志愿者的静脉血样本，保存于抗凝管中。其中男性25名，女性25名。

1.2 试剂与仪器

QIAamp DNA Mini and Blood Mini试剂盒、PyroMark PCR试剂盒、PyroMark Gold Q96试剂盒、结合缓冲液、复性缓冲液、变性缓冲液与洗涤液（德国Qiagen公司）。链霉亲和素包被的磁珠（国药集团化学试剂有限公司）。引物及生物素标记（基康生物公司）。

7500型实时荧光定量PCR仪（美国life公司）；微孔板光度计（美国Biotek公司）；单链DNA制备纯化装置和焦磷酸测序仪（德国Qiagen公司）。

1．3 位点选择

纳入研究的位点分别为：rs220028、rs2074399和rs760087。

1．4 组池构建

本实验中所构建的组池由上述50名无关个体的DNA样本组成。采用Investigator Quantiplex定量试剂盒在7500型实时荧光定量PCR仪上进行DNA浓度的精确定量，每个样本重复3次。R2值≥0．990为有效数据，样本DNA测定浓度必须满足3次测定结果偏差＜5%且样本浓度不低于40 ng/μL。采用Buffer AE（10 mM Tris·Cl，0．5 mM EDTA，pH 9．0）将每个样本浓度稀释至40 ng/uL，采用微孔板光度计再次进行DNA定量，每个样本重复3次。要求3次测定结果偏差＜5%。将稀释后的样本各取1．5 μL，进行等量混合，构建实验用组池。

1．5 引物设计

采用PyroMark Assay Design 2．0软件中的AQ模式进行SNP位点的引物设计。

1．6 PCR扩增与质量检测

采用PyroMark PCR试剂盒对组池样本进行上述3个SNP位点的PCR扩增。具体PCR体系构建及扩增条件参见试剂盒操作说明书。对扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判断PCR产物的质量。

1．7 SNP位点的测序检测

取 PCR扩增产物20 μL，加入40μL结合缓冲液、1．5 μL 链霉亲和素包被的磁珠和 18．5 μL 纯水，1，400 rpm混匀10 min后，置于70%乙醇、变性缓冲液10s，洗涤液洗涤15s，纯化得到标记生物素的单链DNA。将单链DNA模板转入含测序引物（10 μM）的复性缓冲液中，80℃杂交3 min，冷却至室温。将酶混合物（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）、底物混合物（底物APS和荧光素）和4种dNTP按PyroMark Q96软件中规定的数目加入相应试剂舱中，按所建立的测序方法进行测序检测。每个位点的检测重复3次。

1．8 统计分析

对测序结果进行分析，3次所得结果的平均值为该SNP位点的等位基因定量分析结果；依据该结果进行法医学参数的计算；采用Arlequin对本次研究所得频率信息与以往研究中所得频率信息进行差异性分析。

2 结果与讨论

在制备pooling样本池时，最关键的步骤是DNA的等量混匀，混匀的前提在于DNA的精确定量[1-2]。本实验中主要采用的是Investigator Quantiplex定量试剂盒在7500型实时荧光定量PCR仪上进行DNA定量。该试剂盒主要用来确定样本是否含有足量DNA以接受DNA指纹图谱分析等，并确定样本是否含有可能干扰PCR进行的抑制剂。抑制剂的检测主要是将DNA标准内参CT值和未知样本内参CT值进行比较，其中内参阳性扩增产生的CT值约为31。与标准曲线样本相比，可能出现内参CT值有±1范围的波动。对于DNA浓度＜40ng/uL或者含有PCR抑制剂的样本进行DNA重新提取，满足要求后将其进一步稀释至40 ng/uL，再次定量，从而保证定量的准确性及后续PCR反应的顺利进行。

采用 PyroMark Assay Design 2．0软件进行 SNP位点引物设计的信息见表1。pyrosequencing技术在进行DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，可以直接测定引物后面的碱基序列，定量性能好，结果准确，可实现自动化，是一种实时DNA测序技术。检测时产生的荧光信号强度与聚合的dNTP个数成正比，根据加入的dNTP类型和荧光信号强度就可实时记录模板DNA的核苷酸序列。对50份DNA样本所构成的组池样本采用pyrosequencing技术在3个SNP位点进行等位基因定量分析，统计分析结果见表2。通过Arlequin软件统计分析发现，与文献[3]中所报道的rs220028位点频率数据信息无显著性差异（p＞0．05）。

表1 SNP位点进行等位基因定量分析的引物信息

表2 SNP位点的等位基因频率分布及法医学参数

本次研究中所选择的3个SNP位点等位基因频率分布好，多态性好，可满足法医遗传学遗传标记应用要求。其次，Pyrosequencing技术结合pooling方法用于等位基因定量检测的技术准确可靠，方便快捷，可以快速得到SNP位点的多态性信息，适用于位点的初筛及大规模频调。

参考文献：

[1]陈逸飞，钟诗龙，罗建方，等．基于DNA pooling技术的全基因组关联研究筛选主动脉夹层等位基因遗传位点[J]．实用医学杂志，2012，28（20）：3405-3407．

[2]Men T， Zhang X， Yang J， et al．The rs1050450 C＞T polymorphism of GPX1 is associated with the risk of bladder but not prostate cancer： evidence from a meta-analysis[J]．Tumour Biol．2013．

[3]Zhao G， Yang Q，Huang D， et al．Study on the application of parent-of-origin specific DNA methylation markers to forensic genetics[J]．Forensic Sci Int， 2005，154（2-3）：122-7．