HPLC法同时测定金银花及金芪降糖片中9种成分的含量*

陈 芳，邓雁如，郭利平

（天津中医药大学，天津市中药化学与分析重点实验室，天津300193）

·中药研究·

HPLC法同时测定金银花及金芪降糖片中9种成分的含量*

陈 芳，邓雁如，郭利平

（天津中医药大学，天津市中药化学与分析重点实验室，天津300193）

[目的]建立高效液相色谱（HPLC）法同时测定金银花及金芪降糖片中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C 9种成分的含量。[方法]色谱柱为Waters SymmetryShieldTM RP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-水（0.1%磷酸，B），线性梯度洗脱：0～5 min，10%～13%A；5～20 min，13%～15%A；20～30min，15%～18%A；30～45min，18%～20%A；45～52min，20%～23%A；52～70min，23%A，体积流量1.0mL/min，检测波长327 nm；柱温25℃。[结果]9种成分均能达到基线分离，线性关系良好，加样回收率在95%～105%。在该方法下测定了16批金银花药材、11批金芪降糖片中9种成分的含量。[结论]该法专属性强、灵敏度高、重复性好、简便易行，可用于同时测定金银花及金芪降糖片中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C 9种成分的含量，可为金芪降糖片的现代制剂研究和质量控制提供依据。

金芪降糖片；金银花；HPLC；新绿原酸；隐绿原酸；异绿原酸A

金芪降糖片是由金银花、黄连和黄芪组成的一种纯中药制剂，具有清热益气，生津止渴等功效，主要用于气阴两虚并有内热症候的糖尿病患者。该制剂中的金银花为历史悠久的传统中药，其性寒，味甘，具有清热解毒、通经活络、疏散风热之功效[1]。现代药理研究表明其具有抗菌抗病毒、解热、抗炎、调节免疫、利胆保肝、抗氧化、降血脂、止血等显著功效[2-6]，其主要活性成分为有机酸类和黄酮类。金银花中有机酸类成分主要包括绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸等[7-8]。黄酮类成分主要包括木犀草素、木犀草素-7-O-α-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D葡萄糖苷、金丝桃苷、芦丁及5-羟基-3’，4’，7’-三甲基黄酮[9-10]。2010版《中国药典》金银花含量测定项分别测定了绿原酸及木犀草苷的含量[1]。目前，对金银花的含量测定的报道中，大部分只测定了绿原酸和木犀草苷的含量[11]。本实验室于静等[11]曾同时测定金银花及金芪降糖片中6种成分的含量，6种成分分别为绿原酸、咖啡酸、芦丁、木犀草苷、金丝桃苷、异绿原酸C。测定过程中，有一含量较高的成分因缺少对照品无法指认，后经与对照品比对确认其为异绿原酸A，为体现中药制剂多成分、多靶点、多途径的作用特点，本实验建立了HPLC梯度洗脱法同时测定金银花及金芪降糖片中新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C，为进一步完善金芪降糖片的质量控制方法提供依据。

1 仪器与试药

Aglient 1200高效液相色谱仪（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器，美国Aglient公司），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Sartorius LE225D型电子分析天平（德国Sartorius公司）。绿原酸（110753-200413）、咖啡酸（110885-200102）、木犀草苷（111520-200504）、芦丁（100080-200707）、金丝桃苷（111521-200303）对照品购自于中国药品生物制品检定所。新绿原酸（X-014-110822）、隐绿原酸（Y-067-110825）、异绿原酸A（Y-068-120328）、异绿原酸C（Y-070-111128）对照品购自于成都瑞芬思生物科技有限公司。金银花药材由天津市中新药业提供（批号120213、120214、10121402、11030202、11041101、11041803、Y1101021、Y1104107、Y1105175、Y1105181、Y1111245、Y1111247、Y1112292、Y1202036、Y1203053、Y1204032），经天津中医药大学马琳教授鉴定为金银花药材Lonicerae Japonicae Flos。金芪降糖片为市售（批号0902417、0902422、0904435、0905459、0910498、0911475、0912506、1001514、1103628、1105655、1108683），缺金银花阴性对照样品（自制）。乙腈为色谱纯（美国Sigmaaldrich公司）；水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2 实验方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Waters SymmetryShieldTMRP18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为：乙腈（A）-水（0.1%磷酸）（B），线性梯度洗脱程序为0～5 min，10%～13%A；5～20 min，13%～15%A；20～30 min，15%～18%A；30～45 min，18%～20%A；45～52 min，20%～23%A；52～70 min，23%A，体积流量1.0 mL/min，检测波长355 nm、330 nm，柱温25℃，进样体积20 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取新绿原酸4.76 mg、隐绿原酸5.53 mg、绿原酸19.14 mg、咖啡酸4.51 mg、木犀草苷2.95 mg、芦丁10.88 mg、金丝桃苷4.39mg、异绿原酸A11.16mg、异绿原酸C4.04mg，置10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度得各标准品母液。分别移取新绿原酸母液2.236 mL，隐绿原酸母液2.980 mL，绿原酸母液4.690 mL，咖啡酸母液0.660 mL，木犀草苷母液0.896 mL，芦丁母液1.988 mL，金丝桃苷母液0.530 mL，异绿原酸A母液7.570 mL，异绿原酸C母液6.953 mL于同一50 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C质量浓度分别为 21.29、32.96、179.5、5.953、5.286、43.26、4.653、169.0、56.18 μg/mL的混合对照品贮备液，备用。按“2.1”项下色谱条件测定，其色谱图见图1。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 金银花药材提取液的制备 金银花药材60℃干燥2 h，粉碎，过60目筛，混合均匀，称取样品0.2 g，精密称定，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇约49 mL，超声提取1 h，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液为供试液，按“2.1”项下色谱条件测定。其色谱图见图1，以新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C 9种成分的对照品确定色谱峰的归属，外标一点法定量。

2.3.2 金芪降糖片提取液的制备 取同一批号的金芪降糖片20片，除去包衣，粉碎，过60目筛，混合均匀，称取0.4 g，精密称定，置于50 mL棕色容量瓶中，加甲醇约49 mL，超声提取1 h，冷却至室温，加甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液为供试液，按“2.1”项下色谱条件测定。其色谱图见图2，以新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C 9种成分的对照品确定色谱峰的归属，外标一点法定量。

图1 混和对照品（A）和金银花（B）的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A)and Lonicerae Japonicae Flos(B)

图2 金芪降糖片（C）及其阴性对照液（D）的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of Jinqi Jiangtang tablets(C) and negative sample(D)

2.4 线性关系考察 精密量取“2.2”项下混合对照品溶液0.25、0.5、1、2、3、4、5、8、10mL，分别置于10mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以标准品的浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）分别得到9种成分的标准曲线（见表1），线性关系良好。

表1 各对照品的回归方程Tab.1 Regression equations of each reference substance

2.5 精密度实验

2.5.1 金银花精密度实验 精密称取同一批金银花粉末0.2 g，按“2.3.1”项下制备金银花的提取液，并在“2.1”项下色谱条件，连续重复进样6次，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸 C保留时间的 RSD分别为 0.10%、0.17%、0.28%、0.22%、0.18%、0.25%、0.16%、0.07%、0.09%，峰面积的 RSD分别为 0.92%、0.99%、0.67%、0.83%、1.08%、1.68%、0.98%、0.78%、0.41%。

2.5.2 金芪降糖片精密度实验 精密称取同一批金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.1”项下制备金银花的提取液，并在“2.1”项下色谱条件，连续重复进样6次，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C保留时间的RSD分别为0.42%、0.48%、0.49%、0.27%、0.32%、0.34%、0.34%、0.27%、0.37%，峰面积的RSD分别为2.54%、1.16%、0.37%、1.38%、1.66%、2.43%、2.10%、0.20%、0.21%。

2.6 稳定性实验

2.6.1 金银花稳定性实验 精密称取同一批金银花粉末0.2 g，按“2.3.1”项下制备金银花的提取液，并在“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C保留时间的RSD分别为0.13%、0.22%、0.29%、0.19%、0.17%、0.23%、0.16%、0.08%、 0.09%，峰面积的RSD分别为1.34%、1.09%、0.83%、1.57%、0.89%、1.70%、1.05%、0.72%、0.35%。结果表明，金银花药材供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.2 金芪降糖片稳定性实验 精密称取同一批金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.2”项下制备金芪降糖片的提取液，并在“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、16、24 h进样，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C保留时间的RSD分别为0.39%、0.46%、0.47%、0.32%、0.42%、0.45%、0.44%、0.32%、0.44%，峰面积的RSD分别为2.62%、2.06%、0.47%、1.38%、1.69%、2.55%、2.36%、0.23%、0.22%。结果表明，金芪降糖片供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性实验

2.7.1 金银花重复性实验 精密称取同一批次金银花粉末6份，各0.2 g，按“2.3.1”项下制备金银花的提取液，并在“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C保留时间的RSD分别为0.09%、0.16%、0.17%、0.12%、0.18%、0.17%、0.18%、0.08%、0.12%，峰面积的 RSD分别为 1.68%、1.44%、0.76%、1.99%、1.54%、1.43%、1.38%、1.24%、1.65%。表明本方法重复性良好。

2.7.2 金芪降糖片重复性实验 精密称取同一批次金芪降糖片粉末6份，各0.4 g，按“2.3.2”项下制备金芪降糖片的提取液，并在“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，计算。新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C保留时间的RSD分别为0.28%、0.40%、0.43%、0.22%、0.22%、0.23%、0.22%、0.12%、0.20%，峰面积的RSD分别为2.84%、1.91%、1.31%、2.07%、1.40%、2.99%、2.43%、2.21%、2.26%。表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率

2.8.1 金银花加样回收率实验 精密称取已知含量的金银花粉末9份，各0.1 g，加入各对照品的量相当于金银花中各对照品量的80%、100%、120%。按“2.3.1”项下制备金银花的提取液，并在“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算各成分的含量，计算回收率，结果新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸 C的平均回收率分别为 98.49%、99.6%、101.25%、100.43%、101.05%、99.49%、97.30%、98.71%、98.94%，RSD分别为1.98%、2.23%、2.66%、2.01%、2.41%、2.42%、1.99%、1.43%、3.15%。

2.8.2 金芪降糖片加样回收率实验 精密称取已知含量的金芪降糖片粉末9份，每份0.2 g，加入各对照品的量相当于金芪降糖片中各对照品量的80%、100%、120%。按“2.3.2”项下制备金芪降糖片的提取液，并在“2.1”项下色谱条件进行测定，以外标法计算各成分的含量，计算回收率，结果新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、芦丁、金丝桃苷、异绿原酸A、异绿原酸C的平均回收率分别为99.50%、101.70%、98.56%、99.97%、100.00%、100.55%、99.65%、98.33%、102.75%，RSD分别为2.29%、3.51%、2.72%、2.73%、2.94%、2.23%、2.51%、1.80%、0.85%。

2.9 阴性对照液 取除金银花以外的各原药材，按“2.3.2”项下方法制备金芪降糖片的阴性对照液，并在“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见图2。结果表明，本实验条件下，金芪降糖片中的黄芪、黄连对实验结果没有影响。

2.10 样品的含量测定

2.10.1 金银花药材的含量测定 精密称取不同批次金银花粉末各0.2 g，按“2.3.1”项下制备金银花提取液，并在“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表2。

2.10.2 金芪降糖片的含量测定 精密称取不同批次金芪降糖片粉末0.4 g，按“2.3.2”项下制备金芪降糖片提取液，并在“2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表3。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 通过三维图谱提取9种成分的光谱，表明绿原酸在242 nm、305 nm及327 nm附近有最大吸收，新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C均在242 nm、298 nm及327 nm附近有最大吸收，咖啡酸在238 nm及322 nm下有最大吸收，木犀草苷、芦丁、金丝桃苷在254nm及354nm附近有最大吸收，同时在327 nm处的吸收也较大。绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C在354 nm处也有吸收，但其在354 nm处的吸收明显低于327 nm处的吸收。为了能简便、快速地检测各化合物的含量，综合考虑各被测成分的吸收波长，最终选定检测波长为327 nm。

表2 金银花药材测定结果（n=3）Tab.2 Determination of Lonicerae Japonicae Flos（n=3）mg/g

表3 金芪降糖片含量测定结果（n=3）Tab.3 Determination of Jinqi Jiangtang tablets（n=3） mg/片

3.2 流动相的选择 由于金银花成分复杂，单一流动相无法达到很好的分离效果，而采用梯度洗脱可以在整个分析时间段内，各色谱峰达到很好的分离效果且相对保留时间稳定。孙玉刚等[13-14]同时测定绿原酸及隐绿原酸的含量采用乙腈-0.1%甲酸为流动相。本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液。综合考虑各被测成分的分离度及峰型，最终确定选用乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，各被测成分均能达到基线分离。

3.3 稳定性的控制 实验中发现，新绿原酸、隐绿原酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C对照品溶液、金银花药材提取液、金芪降糖片提取液稳定性较差，温度过高或放置时间较长易分解，各被测成分会分解，使各被测成分的含量发生变化，因此在配制相关对照品及供试品时，选用棕色容量瓶，避免光照，并在配制后保存于低温条件下。

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Simultaneous determination of nine components in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet by HPLC

CHEN Fang,DENG Yan-ru,GUO Li-ping
（Tianjin Key Laboratory of Chinese Medicine Chemistry and Analysis,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a HPLC method for simultaneous determination of neochlorogenic acid,cryptochlorogenic acid, chlorogenic acid,caffeic acid,cynaroside,rutin,hyperoside,isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet.[Methods]The chromatographic conditions were follows:Waters Symmetry Shield TM RP18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm),acetonitrile(A)and water(0.1%phosphoric acid,B)as mobile phases for gradient elution,0～5 min，10%～13%A,5～20 min,13%～15%A；20～30 min，15%～18%A；30～45 min，18%～20%A；45～52 min，20%～23%A；52～70 min，23%A;the flow rate being 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 327 nm and the column temperature was 25℃.[Results]The results showed that nine components were well separated and showed good linearity.The average recoveries were between 95%～105%.[Conclusion]This is a specific,sensitive,repeatable and simple method for simultaneous determining neochlorogenic acid,cryptochlorogenic acid,chlorogenic acid,caffeic acid,cynaroside,rutin,hyperoside,isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C in Lonicerae Japonicae Flos and Jinqi Jiangtang tablet.The method can be available for the quality control of Jinqi Jiangtang tablet.

Jinqi Jiangtang tablet;Lonicerae Japonicae Flos;HPLC;neochlorogenic acid;cryptochlorogenic acid;isochlorogenic acid A

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0168-05

2013-09-24）

（本文编辑：高 杉，马晓辉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.14

国家自然科学基金项目（81073033），国家重点基础研究发展计划项目（2009CB523003）。

陈 芳（1986-），女，在读硕士研究生，研究方向为药物分析。

邓雁如，E-mail:dyanru@sina.com。