松龄血脉康胶囊对肝阳上亢型肾性高血压大鼠作用机制的研究*

李 杰，赵英强，柳 威

（1.天津中医药大学第二附属医院心内2科，天津 300150；2.天津中医药大学，天津 300193）

·实验研究·

松龄血脉康胶囊对肝阳上亢型肾性高血压大鼠作用机制的研究*

李 杰1，赵英强1，柳 威2

（1.天津中医药大学第二附属医院心内2科，天津 300150；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]研究松龄血脉康胶囊对肝阳上亢型肾性高血压大鼠的作用机制。[方法]采用左肾动脉结扎并灌服附子汤的方法复制肝阳上亢型高血压大鼠模型。筛选造模成功的SD大鼠24只，随机分成3组（模型组、中药组、西药组）。另以8只正常SD大鼠作为空白组。中药组给予松龄血脉康胶囊，西药组给予雷米普利，空白组和模型组给予生理盐水，连续4周。观察大鼠的外观及易激惹程度，测定痛阈、血压、心脏超声和血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量，检测组织血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）、血管紧张素转换酶（ACE）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、内皮素（ET）mRNA表达量。[结果]肝阳上亢型高血压大鼠造模成功；给药组大鼠症状明显好转，血压下降，血浆AngⅡ、ALD含量降低，组织AT1R、ACE、ET mRNA表达量降低，eNOS mRNA表达量增高；舒张末期左室内径（LVDd）、收缩末期左室内径（LVDs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）均显著降低，射血分数（EF）显著升高。[结论]松龄血脉康能有效改善肝阳上亢症状，通过干预肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）和内皮素-一氧化氮（ET-NO）系统有效地降低血压，进一步抑制心室重构，改善心功能。

松龄血脉康胶囊；肝阳上亢型高血压；肾素-血管紧张素-醛固酮系统；ET-NO

高血压病属于中医“眩晕”、“头痛”等病证范畴。中医认为其病因多为风、火、痰、瘀、虚，病机为风火痰瘀等实邪在体内日久化火化热，扰乱肝阳，气火上逆所致的肝火上炎；或者患者体内阴虚，用阳太过，阳亢耗阴所致的肝阳上亢。现代文献研究和临床实践表明，高血压患者肝阳上亢型为最多[1-2]。因此研究该证型的治疗对于高血压病、中风的防治均有重要意义[3]。松龄血脉康胶囊具有平肝潜阳、镇心安神功效。本实验采用左肾动脉结扎法复制肾性高血压大鼠模型，再灌服附子汤复制肝阳上亢型高血压模型。观察松龄血脉康对肝阳上亢型高血压症状的改善情况及降压机制。

1 材料

1.1 实验动物 正常10周龄雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2009－0010。饲养于室内通风橱内，恒温（22±2）℃，自然昼夜，自由取食及饮水。

1.2 药品和试剂 雷米普利由赛诺菲安万特（北京）制药有限公司生产，每片5 mg，批号：C0001；松龄血脉康胶囊（含葛根、珍珠层粉等）由成都康弘制药有限公司生产，每粒0.5 g，批号：100513；附子购于亳州市中药饮片厂；血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所；实时定量PCR试剂均购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 主要仪器 无创鼠尾压测量仪（BP98AWU，日本软隆）；彩色超声心动仪（GEL-400）；DY89-1实时定量 PCR仪-Linegene 9620（BIOER）；PCR仪-杭州博日科技有限公司TC-96/g/h（b）。

2 方法

2.1 肾性高血压造模 正常10周龄雄性SD大鼠，适应性喂养2周后，行左肾动脉结扎手术[4]。手术前自由饮食，术前24 h停止喂食，但供应饮水，术前隔天不同时间测定大鼠尾动脉血压3次，取平均值。手术用金属器械和玻璃器械及丝线等，术前进行高温消毒，准备外径为0.25 mm的针灸针若干根，去尖，断端处理圆滑，弯曲成弧形，消毒保存备用。用3%戊巴比妥钠1 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定手术台上，剪去左侧腹部及左肾区约3 cm×4 cm的被毛，分别用1%碘酒和75%乙醇消毒皮肤，切开皮肤约3 cm，切口与腹正中线平行，用拉皮钩固定，止血钳顿性分离腹部肌肉层，手术镊子夹取敷料小心推开肠管及胰腺等内脏器官，暴露左肾，用玻璃分针小心分离肾动脉，把制备好的针灸针紧贴左肾动脉平行放置，用消毒的手术丝线将两者一起捆扎，不可用力过轻或突然用力以防勒断肾动脉，丝线系牢后，小心抽去银针，左肾动脉血流被部分阻断。依次缝合肌肉和皮肤，2 d内腹腔注射青霉素20 000～30 000 U，术后24 h禁食，观察大鼠活动情况，自由饮水。情况稳定喂食颗粒饲料。手术2周后，以尾动脉收缩压较手术前升高10mmHg以上，超过140 mmHg者为造模成功。

2.2 分组及给药 筛选造模成功的大鼠24只，采用随机数字表法随机分成3组（模型组、中药组、西药组），每组8只。另以8只正常SD大鼠作为空白组。模型组、中药组、西药组3组大鼠均灌服附子汤，20 mL/（kg·d）灌胃，相当生药2 g/（kg·d），灌胃1周。之后，中药组以松龄血脉康胶囊20 mg/（kg·d）灌服；西药组以雷米普利1 mg/（kg·d）灌服，空白组和模型组给予同体积的生理盐水，连续4周。用药4周后检测各项指标。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠外观及易激惹程度观察 每周观察大鼠的外观体征和行为活动等变化，观察大鼠易激惹程度并分级。Ⅰ级（1分）：捉持颈部时尖叫、惊跳。Ⅱ级（2分）：捉持颈部时激怒咬人。Ⅲ级（3分）：捉尾部时尖叫、惊跳甚至欲咬人或同笼大鼠频繁打斗，频咬铁笼。上述情况不明显者为0级（0分）。

2.3.2 血压测定 采用尾动脉无创测压法。在干燥、通风、安静的环境中将大鼠置于37℃恒温袋内预热10 min，使大鼠尾动脉充分扩张，将传感器套在鼠尾根部，待大鼠短暂躁动停止后，连续测定3次取平均值作为血压。

2.3.3 痛阈测定 采用尾电刺激法，用痛阈测量仪作方波脉冲电流刺激，频率8 Hz，波宽2 ms，电流强度为3 A，开始计时直至大鼠出现嘶叫，以此时的时间为痛阈。连测3次，间隔时间为5 min，取其均值。

2.3.4 心脏超声测定 使用GEL-400彩色超声心动仪，探头频率为9 MHz，测量并记录舒张末期左室内径（LVDd）、收缩末期左室内径（LVDs）、舒张末期室间隔厚度（IVSd）、收缩末期室间隔厚度（IVSs）、舒张末期左室后壁厚度（LVPWd）、收缩末期左室后壁厚度（LVPWs）、射血分数（EF）值等。

2.3.5 血浆AngⅡ、ALD含量测定 取大鼠眼眶血快速加入含有肝素的离心管中，颠倒混匀，4℃、3 000 r/min离心5 min，取上清液，参照ALD和AngⅡ测定试剂盒说明书，进行放射免疫分析测定。

2.3.6 肝脏AT1R、ACE、eNOS、ET mRNA表达量测定 大鼠腹主动脉取血后，取肝脏使用Trizol试剂提取总mRNA，引物序列见表1。

表1 AT1R、ACE、eNOS、ET和β-Actin的上游引物和下游引物Tab.1 Upstream primers and downstream primers of AT1R,ACE,eNOS,ET and β-Actin

取总RNA1μg，按说明书进行逆转录合成cDNA。荧光定量PCR反应条件为：95℃，15min；95℃，20 s；AT1R 57℃，ACE 54℃，eNOS 57℃，ET 57℃，20 s；40个循环，反应体系为20 μL。选取15～25个扩增循环数（Ct）的荧光信号，计算3个平行复孔的扩增效率，计算ΔCt和ΔΔCt。ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，ΔΔCt=（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因），计算实验组目的基因与对照组目的基因的差异表达量2-ΔΔCt（2-ΔΔCt=实验组目的基因/对照组目的基因）。

2.4 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析进行统计处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肾性高血压肝阳上亢证模型大鼠易激惹程度变化 空白组8只SD大鼠的易激惹程度，在本实验始末大多保持在0级和Ⅰ级水平。灌附子汤后，模型组、中药组、西药组3组大鼠易激惹程度发生了变化，多表现为Ⅲ级，且大部分出现了眼结膜充血；与模型组比较，用药后，中药组和西药组大鼠易激惹程度及眼结膜充血均较前好转，易激惹程度多表现为Ⅰ和Ⅱ级。详见表2。

表2 各组大鼠一般体征比较Tab.2 Comparison of general signs in each group 只

3.2 各组大鼠血压的变化 空白组、模型组、中药组、西药组4组大鼠基础血压无差别。肾动脉结扎后，模型组、中药组、西药组血压显著上升，与空白组比较，3组差异均有显著性（P<0.01），但组间血压无统计学差异。灌附子汤后，3组血压继续升高，而3组间血压仍无无统计学差异。用药1周后血压开始下降，随着给药时间的延长，血压逐渐降低。给药3周后，中药组血压接近空白组水平，和西药组比较无统计学差异。见表3。

3.3 痛阈变化 与空白组比较，模型组降低，有统计学差异（P<0.01），中药组及西药组无统计学差异。与模型组比较，中药组和西药组均升高，有统计学差异（P<0.01）。与西药组比较，中药组升高，但无统计学差异（P>0.05）。见图1。

3.4 心脏超声检测结果 与空白组比较，模型组的LVDd、LVDs显著增大（P<0.01），模型组LVPWd、LVPWs增大（P<0.05），模型组EF显著降低（P<0.01）。与模型组比较，中药组及西药组LVDd、LVPW、LVDs、LVPWs均降低，EF升高（P<0.05）。与西药组比较，中药组心脏超声各项指标均无统计学差异。见表4。

图1 各组大鼠痛阈比较Fig.1 Comparison of pain threshold in each group

3.5 血浆AngⅡ、ALD含量测定结果 与空白组比较，模型组AngⅡ、ALD含量显著升高（P<0.01）。与模型组比较，中药组、西药组的AngⅡ、ALD含量显著降低（P<0.01）。与西药组比较，中药组AngⅡ含量较高，有统计学差异（P<0.01），而ALD含量无统计学差异。见表5。

表3 各组大鼠收缩压比较（±s）Tab.3 Comparison of the systolic blood pressure in each group（±s） mm Hg

表3 各组大鼠收缩压比较（±s）Tab.3 Comparison of the systolic blood pressure in each group（±s） mm Hg

注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较#P<0.05，##P<0.01；与西药组比较△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别空白组模型组中药组西药组n 8 8 8 8基础血压 肾动脉结扎后 灌附子汤后 给药1周 给药2周 给药3周 给药4周132.41±3.87 130.75±1.17 133.66±5.04 133.83±4.35 134.50±5.68 136.33±4.13 133.66±3.44 132.00±3.84 147.00±3.84** 148.04±5.10** 149.33±4.04** 147.83±4.16** 148.00±4.47** 148.83±3.54** 130.54±3.15 145.54±3.15** 150.29±3.57** 139.79±5.40*##△△138.16±4.35##△△134.75±6.29##134.08±5.80##130.12±3.12 145.12±3.12** 147.66±5.12** 129.83±5.65##129.12±6.20##129.79±3.70*##129.03±4.44##

表4 各组大鼠心脏超声比较（±s）Tab.4 Comparison of the echocardiography in each group（±s）

表4 各组大鼠心脏超声比较（±s）Tab.4 Comparison of the echocardiography in each group（±s）

注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01;与西药组比较△P<0.05,△△P<0.01。

组别空白组模型组中药组西药组n 8 8 8 8 LVDd（mm） LVDs（mm） IVSd（mm） IVSs（mm） LVPWd（mm） LVPWs（mm） EF（%）6.22±0.38 3.65±0.12 0.80±0.11 0.97±0.09 0.77±0.09 1.17±0.05 85.94±2.99 7.56±0.28** 4.86±0.12** 0.76±0.18 1.03±0.05 0.96±0.10* 1.36±0.13* 75.60±1.60** 6.25±0.13##3.70±0.17##0.66±0.05 0.96±0.10 0.73±0.13##1.03±0.13##85.68±3.04##6.36±0.20##3.80±0.15##0.63±0.10 0.94±0.11 0.80±0.15#1.02±0.14##87.33±1.63##

3.6 肝脏AT1R、ACE、eNOS、ET mRNA表达量结果AT1R mRNA表达量：与空白组比较，模型组显著上调（P<0.01）；与模型组及西药组比较，中药组显著下调（P<0.01）。ACE mRNA表达量：与空白组比较，模型组显著上调（P<0.01）；与模型组比较，中药组显著下调（P<0.01）；与西药组比较，中药组高于西药组（P<0.01）。eNOS mRNA表达量：与空白组比较，模型组显著下调（P<0.01）；与模型组比较，中药组和西药组均显著上调（P<0.01）。ET mRNA表达量：与空白组比较，模型组显著上调（P<0.01）；与模型组比较，中药组和西药组均显著下调（P<0.01）。详见表6。

表5 各组大鼠AngⅡ和ALD含量的比较（±s）Tab.5 Comparison of AngⅡand ALD in each group（±s）

表5 各组大鼠AngⅡ和ALD含量的比较（±s）Tab.5 Comparison of AngⅡand ALD in each group（±s）

注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01;与西药组比较△P<0.05,△△P<0.01。

组别 n AngⅡ（ng/L） ALD（pg/mL）空白组 8 1 598.73±26.57 165.43±18.23模型组 8 1 821.14±35.82** 322.28±17.27**中药组 8 1 499.07±35.22**##△△163.72±12.53##西药组 8 1 423.99±25.19**##161.20±17.50##

表6 各组大鼠AT1R、ACE、eNOS、ET mRNA表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of mRNA expression of AT1R,ACE, eNOS and ET in each group（±s）

表6 各组大鼠AT1R、ACE、eNOS、ET mRNA表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of mRNA expression of AT1R,ACE, eNOS and ET in each group（±s）

注：与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较#P<0.05,##P<0.01;与西药组比较△P<0.05,△△P<0.01。

组别空白组模型组中药组西药组n 8 8 8 8 AT1R ACE eNOS ET 1 1 1 1 1.69±0.06** 1.61±0.04** 0.55±0.21**1.60±0.27** 1.00±0.07##△△0.86±0.07**##△△1.17±0.12##1.07±0.19##1.65±0.06** 0.70±0.05**##1.14±0.15##1.09±0.19##

4 讨论

高血压病属于中医“眩晕”、“头痛”等病证范畴，其病位在肝，根源在肾[4]。文献表明，高血压患者中医证候以肝阳上亢型为最多[1-2]。中医对高血压辨证论治有很好的疗效[5-7]。本实验通过结扎大鼠左肾动脉，造成高血压模型；再灌服附子汤，造成肝阳上亢模型。且大鼠外观及易激惹程度、痛阈均发生了明显的变化，血浆AngⅡ含量也显著升高，与文献报道一致[8]。表明成功复制了高血压肝阳上亢型大鼠模型。用药4周后，高血压肝阳上亢型大鼠外观及易激惹程度较前明显好转，痛阈达到空白组正常大鼠水平。说明松龄血脉康能有效改善肝阳上亢症状，验证了松龄血脉康确实具有平肝潜阳、镇心安神之功效。而且用药后大鼠的血压开始下降，随着给药时间延长，血压逐渐降低，疗效等同于西药组。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）是调节血压的一个重要系统[9]。如血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）能使血管收缩，血压升高[10]。本研究发现松龄血脉康能下调肝脏AT1R、ACE mRNA表达量，降低血浆AngⅡ、ALD含量。提示松龄血脉康能有效干预RAAS的关键环节，对血压进行调控。此外，ET-NO也是调节血压的一条重要途径[11]。高血压时，内源性NOS抑制物水平升高可竞争性抑制eNOS活性，导致NO合成受阻引起内皮舒张功能不全[12]。内皮素（ET）是迄今知道的作用最强的收缩血管物质，在病理情况下，一氧化氮（NO）减少或活性降低，而ET释放增加，ET升高又加重高血压的病理过程[13]。本实验也发现，松龄血脉康能上调组织eNOS mRNA表达量，同时抑制ET mRNA的表达。提示松龄血脉康能作用于ET-NO系统，促进舒血管活性因子的分泌和减少缩血管活性物质的产生。高血压是引起左心室肥厚的重要原因。本实验提示松龄血脉康能抑制心室重构，改善心功能。

松龄血脉康不但能有效改善肝阳上亢症状，而且通过干预RAAS和ET-NO系统有效地降低血压，进一步抑制心室重构，改善心功能。

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Mechanism of Songling Xuemaikang capsule on renal lypertension in rats with liver Yang hyperactivity

LI Jie1,ZHAO Ying-qiang1,LIU Wei2
（1.The Second Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300150,China;2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To research the blood pressure regulating mechanism of Songling Xuemaikang capsule in treating renal hypertension in rats with hyperactivity of liver yang.[Methods]Hypertension in the model group of rats with hyperactivity of liver yang was reproduced by ligaturing the left renal artery and oral infusion with monkshood soup.The 24 SD rats with successful reproduction of hypertension were randomly divided into 3 groups,including model group,Chinese medicine group and Western medicine group.The other 8 normal SD rats were served as blank group.Songling Xuemaikang capsule was given to the rats of Chinese medicine group and Ramipril was given to Western medicine group,while the same volume of saline was fed to the animals in blank group and model group for 4 weeks.The appearance of signs and degree of rats’irritability were observed.The pain threshold,blood pressure,ultrasonic cardiogram,AngⅡand ALD were measured.The expression of AT1R,ACE,eNOS and ET mRNA in tissue were measured.[Results]In the model group these hypertensive rats with hyperactivity of liver yang were reproduced successfully.The Songling Xuemaikang capsule could also improve the irritability symptoms of rats.The increased blood pressure could be inhibited and declined gradually,and the AT1R,ACE,ET mRNA expression were decreased,but the eNOS mRNA was increased after 4 weeks’treatment of Songling Xuemaikang capsule.At the same time,the indicators about LVDd,LVDs,LVPWd and LVPWs were lower.EF was increased significantly.[Conclusion]Songling Xuemaikang capsule can improve the symptoms about hyperactivity of liver yang,reduce the blood pressure by affecting the systems RAAS and ET-NO.In the end the ventricular remodeling is inhibited and the cardiac function is improved.

Songling Xuemaikang capsule;hyperactivity of liver Yang hypertension;RAAS;ET-NO

R285.5

：A

：1672-1519（2013）11-0160-05

2013-07-02）

（本文编辑：马 英，马晓辉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.12

国家重点基础研究发展计划（973）项目（2011CB505100）；天津市自然科学基金项目（09JCZDJC20600）。

李 杰（1977-），女，主治医生，主要从事中西医结合治疗心血管疾病。