一种基于酵母3’，5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白亲和层析纯化体系

浙江师范大学生化学院 张晓 杨洋 孙梅好

一种基于酵母3’，5’-二磷酸核苷酸酶的蛋白亲和层析纯化体系

蛋白质是生命活动的主要承担者。蛋白质的结构和功能的研究在后基因组时代尤为重要。为深入分析蛋白质的结构和功能，

研究者们需要分离纯化大量不同的蛋白质。亲和层析具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点已成为纯化蛋白质等生物大分子最有效的技术之一。目前，常用的亲和层析标签有多聚组氨酸、谷胱甘肽转硫酶、麦芽糖结合蛋白等，但不同的标签各有其优缺点。例如：研究发现如果表达的蛋白表面有几个接近的组氨酸，此蛋白可能结合Ni-NTA介质，最终和目的蛋白一同洗脱下来，导致多聚组氨酸标签纯化的蛋白纯度不够；麦芽糖结合蛋白标签的缺点为层析介质价格较高且纯化的目的蛋白纯度较低；谷胱甘肽转硫酶标签的缺点为标签蛋白中半胱氨酸的氧化可导致目的蛋白凝集，且此蛋白与其配体的结合较慢，因此，我们需要降低上样流速，延长样品的上样时间等。最近，我们开发了以酵母

3’，5’-二磷酸核苷酸酶作为原核蛋白表达和分离纯化的标签。本文主要对其蛋白纯化原理和方法进行总结。

一、3’，5’-二磷酸核苷酸酶

3’，5’二磷酸核苷酸酶水解3’，5’二磷酸腺苷或者3’-磷酸腺苷5’-磷酰硫酸的3’磷酸基团，分别产生5’-单磷酸腺苷和腺苷5’-磷酰硫酸。此酶可通过调节胞内PAP的浓度，从而调节硫酸转移酶、酰基转移酶、RNA处理相关酶的活性，参与细胞的硫代谢和耐盐性。来自酵母的3’，5’二磷酸核苷酸酶也称为HAL2，属于镁离子依赖、锂离子敏感的磷酸单酯酶超家族，可提高酵母的耐盐性。HAL2和PAP具有较高的亲和力，且市场上可买到PAP琼脂糖，使得研究者可利用PAP琼脂糖从酵母和猪肝脏中纯化

3’，5’二磷酸核苷酸酶，且分析表明KmPAP大约为0.7～17.0M。因此，3’，5’二磷酸核苷酸酶可以开发为蛋白纯化的亲和标签。

二、HAL2特性分析

为深入分析HAL2是否可用来作为蛋白纯化的标签，我们从酵母基因组中克隆HAL2基因，参照发表文献方法进行了蛋白纯化。动力学分析结果表明KmPAP和KcatPAP分别为0.25(±0.02)μM和10.8(±0.3)s-1。钙离子作为镁离子的竞争性抑制剂，1mM钙离子可完全抑制HAL2对PAP的水解活性。我们利用荧光标记的PAP类似物，进行解离常数的测定，发现在pH8.0的条件下，其Kd为8 nM，且利用EGTA螯合钙离子可有效解离HAL2·PAP复合体。另外，我们利用荧光标记PAP类似物（mPAP)，进行mPAP与HAL2的结合测定，发现在pH6.0，7.0，7.5，8.0和9.0条件下，其Kd分别是433(±139)nM，68.0(13.0)nM，7.6(±2.5)nM，8.5(±1.6)nM和50.9(±7.0)nM。在pH7.5和8时，其亲和能力最强，其Kd约为8nM。

三、亲和层析步骤的合理设计

根据相关结果，为更经济、有效地纯化HAL2标签蛋白，我们认为应注意以下几点：

1.溶液pH：经研究，我们所选用溶液的pH7.5-8.0。

2.胞内广泛存在的磷酸酶：纯化体系的溶液中加入EDTA(10 mM)螯合镁离子以消除磷酸酶活性。

3.钙离子的应用：钙离子可以促进HAL2与PAP的结合，应用EGTA螯合钙离子进行蛋白的洗脱。

四、载体的构建

为了更有效的利用HAL2作为蛋白纯化标签，我们将3’端有人鼻病毒3C蛋白酶识别位点编码序列（R3CR）的HAL2连接入pET24a（NdeI和HindIII），构建pHAL载体。为验证此载体是否有效可行，我们克隆了大肠杆菌APS激酶（APSkinase，APSK）基因，并利用HindIII和XhoI酶切位点插入pHAL，构建HAL-APSK融合蛋白表达载体（pHAL-APSK）。PCR扩增无R3CR序列的HAL2，并连接入pET24a（NdeI和HindIII），然后利用HindIII和XhoI位点插入人鼻病毒3C蛋白酶基因（R3C），构建HAL3C蛋白酶表达载体（pHAL3C）。

五、蛋白表达纯化

转化表达载体至表达菌株BL21（DE3），利用LB培养基培养至OD600=0.5左右，加入0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达蛋白，于16℃诱导表达16hr后，离心收集菌体。利用裂解液悬浮菌体，经4℃温浴1h后，超声波破碎细胞。离心取上清液，上样至经裂解液平衡的PAP琼脂糖凝胶柱；上样结束后，用10倍体积的裂解液洗涤层析柱；然后，用10倍体积的高盐洗涤液洗涤；再利用10倍洗涤液洗涤层析柱；最后利用洗脱液洗脱获得融合蛋白HAL-APSK和HAL3C。HAL3C蛋白经浓缩定量后，于-80℃冰箱保存备