单克隆抗体技术的研究进展

潘 艳，张 昕

（吉林工商学院 食品工程学院，吉林 长春130507）

1975年，Kohler 和Milstein 首次报道，将不能产生特异性抗体但长寿的小鼠骨髓瘤细胞和可产生特异性但短寿的浆细胞（绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞）在体外进行融合，所产生的杂交瘤细胞既具有分泌绵羊红细胞抗体的特性又有无限繁殖的能力。[1]这一发现启发了科学家利用B 细胞杂交技术成功地制备了单克隆抗体。单克隆抗体具有特异性强、效价高、均质性、少或无血清交叉反应、易于大量生产、成本低等优点，它在疾病治疗和临床实践中具有极大的应用潜力。但迄今所获得的单克隆抗体多为鼠源性，对人而言具有较强的免疫原性，在人体内可引起较强的人抗鼠抗体反应[2]，从而严重地限制了单克隆抗体在人体内的应用。此外，鼠源性单克隆抗体不能与人类抗体Fc 受体结合。[3]这也使得单克隆抗体在治疗方面陷入了低谷。随着重组DNA 技术的发展，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，部分或全人源化的单克隆抗体技术在全世界范围内发出了夺目的光彩。嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所制备的单克隆抗体取得了激荡人心的丰硕成果。这些技术为单抗在临床治疗中更加迅速腾飞且可有效解决传统杂交瘤技术所存在的问题,为单克隆抗体的应用提供更广阔的空间。本文就鼠源性单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人源性抗体技术研究进展及目前单抗在疾病治疗及临床诊断等的应用予以详细介绍。

一、鼠源性单克隆抗体

杂交瘤单克隆抗体制备技术的基本原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞在体外进行融合，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。由于单抗的应用是从体外诊断向体内肿瘤定位和治疗方向发展，故鼠源性单抗出现了难以克服的缺点，特别是在体内应用时，存在主要组织相容性抗原（MHC）和超敏反应问题。随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用，降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。为了克服这一问题科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人—鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。[4]

二、人鼠嵌合抗体

1984年Morrison[5]等人成功地构建了第一个人鼠单克隆抗体即嵌合抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的可变区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体。[6-7]基本原理：抗体分子的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的，而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体，使其重链和轻链的可变区来自小鼠，恒定区来自人源性。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性，又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体，在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果。鼠单克隆抗体可变区的人源化应运而生。

三、人源化单克隆抗体

1.改形抗体

1986年，Jones等人成功构建了第一个改形抗体[8]，又称CDR移植抗体和人源化抗体，指将鼠单抗可变区中互补决定区（CDR）序列取代人源抗体相应CDR 序列，重组构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的CDR 移植抗体。迄今为止，已有100 多种鼠单抗通过CDR 移植得到了人源化。基本原理：抗体重链和轻链的可变区主要由CDR 和骨架区（FR）组成。其中可变区的6 个CDR 是负责识别和结合抗原的区域，它们直接与抗原接触，决定了抗体的特异性。骨架区是可变区以外的其它部分，主要起着支持CDR 的作用，而且它们的氨基酸组成和排列相对不易改变，因此，可以将鼠单抗的CDR 移植到人单抗的骨架区，就有可能使人单抗获得鼠单抗一样的抗原特异性，并可以最大限度地降低鼠单抗的异源性，这样就得到了改形抗体。与嵌合抗体相比，改形抗体进一步减少了抗体中鼠源部分的比例，降低了人抗鼠抗体，但仍有抗体可能导致抗独特型抗体的产生且存在一些局限性，例如构建方法相对复杂，操作起来费时费力；抗体的晶体结构以及电脑模拟抗体的微细结构上都有很大的问题；降低免疫原性和保持抗原结合活性方面还有很多问题。理所当然，寻找既能实现人源化又可以保持高的免疫学活性的简单易行方法势在必行。

2.表面氨基酸残基人源化——镶面抗体

1991年由Padlan 提出的与CDR 移植完全不同的降低鼠源抗体免疫原性的方法。[9]其理论依据是分析了大量鼠单抗可变区和人单抗可变区氨基酸残基的表面暴露情况，结果发现这些暴露的氨基酸残基位置和数量都非常保守，不因为种属和型别而改变。研究表面，这些暴露的氨基酸残基是鼠源可变区免疫原性的主要来源。将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的，就可以使可变区表面人源化，消除了异源性而不影响可变区的整体空间构象。

3.表位印记选择

表位印记选择指的是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术相结合的人源化抗体的方法，可以通过数论筛选就能得到完全人源的抗体。基本原理：鼠单抗的一个重链或者轻链可变区基因与人源抗体的重链或者轻链的可变区基因文库配对，得到杂合的人鼠抗体库。借助噬菌体抗体库的高效筛选方法，能迅速得到所需抗体，比CDR 移植简单且能得到真正的人抗体。缺点：筛选工作量特别大。

四、小分子抗体

小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体片段，它的抗体分子的抗原结合部位仅仅局限于重链和轻链的可变区。虽然分子很小但它既保持了亲本单抗的亲和力具有亲本单抗一样的特异性。种类主要包括：抗原结合片段（Fab）抗体、Fv 抗体、单链抗体、单域抗体、最小，而且识别单位。

1.Fab 抗体

Fab 抗体为仅含Fab 分子，Fab 段由完整的轻链（恒定区CL 和可变区VLCL）和重链Fd 段（第一恒定区CH1 和可变区VH）通过一个二硫键连接形成异二聚体，整个分子大小约占总抗体的三分之一，仅含有一个抗原结合位点。将完整轻链和重链Fd 的编码基因进行连接，可在大肠杆菌中表达，形成完整的二硫键和立体折叠，可以保存Fab 断的功能。常被用于实验室的研究工具。

2.Fv 抗体

Fv 抗体仅由轻链和重链的可变区组成通过非共价键连接，是抗体分子保留完整抗原结合部位的最小功能片段。该片段由于是通过非共价键连接的，所以稳定性不好，十分容易解离。采用适当的方法来解决Fv 片段稳定性问题。

3.单链抗体

单链抗体的问世解决了Fv 抗体的稳定性问题。它由适当的寡核苷酸序列将轻链和重链可变区连接而成，形成单一链的分子，故称为单链抗体。就是单一肽链的结构大大增加了Fv 片段的稳定性。相对完全抗体而言，单链抗体在临床上作为治疗剂有好多优越性。但它也有亲和力下降等缺点。

4.单域抗体

单域抗体仅含重链可变区，结构比Fv 的亚单位还小，它是一个具有抗原结合活性的分子。同完整抗体相比，单域抗体仍然具有与抗体结合的同等能力及稳定性。

5.最小识别单位

比单域抗体还小的最小识别单位仅含可变区中单一CDR 结构，分子量十分小仅占完全抗体的1%左右，亲和力也相当低，所以被命名为最小识别单位。虽然最小识别单位分子量小、亲和力低，但是它具有与抗原结合的能力。

五、人源性单克隆抗体

从最初的鼠源单抗技术到人源化技术，单克隆抗体在几十年的岁月中取得了突飞猛进的发展。人源化的问世使单克隆抗体基本解决了人抗鼠源性问题。但有用人源化的抗体基因均来自杂交瘤细胞。杂交瘤的这个操作过程很复杂且耗时加之利用杂交瘤技术难以制备自身抗原抗体和全人源抗体，这两大缺点成为基因工程抗体应用的绊脚石。随着科学技术的不断进步单克隆抗体进入了一个崭新的发展阶段——人源性单克隆抗体。它主要包括噬菌体抗体库技术、转基因小鼠制备人源性抗体、核糖体展示技术三部分。

1.噬菌体抗体库技术

1985年，Smith G P 将体外克隆的抗体基因片段通过基因工程技术插入噬菌体载体中，从而在噬菌体表面以融合蛋白的形式展示，然后用抗原筛选可获得特异的单克隆噬菌体抗体即为噬菌体展示技术。[10]美国Scripps 研究所Lerner 实验室在1989年首次应用噬菌体表面展示技术构建了噬菌体抗体库。[11]运用这一技术可以获得人源性抗体。迄今为止，应用这一技术产生出来的抗体至少有14 个已用于临床试验中。[12]基本原理和程序：用PCR 扩增人抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA。通用引物具有人的种属普遍性。抗体的VH 和VL 基因的随机重组也增加了抗体的多样性，避开了人工免疫和杂交瘤技术。抗体库的大容量、抗体库极高的筛选效率、可获得高亲和力的人源化抗体。VH 和VL 基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体。与杂交瘤技术相比，噬菌体抗体库技术有着质的变化，但是它仍有不足之处以至于不能满足广大人们的需要，比如操作的简便性及抗体库的容量无法涵盖一些动物的抗体多样性，所以科学家们一直寻找理想的筛选技术以便进行抗体分子的定向进化和抗体筛选的研究。

2.核糖体展示技术

1994年，Mattheakis等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统,利用“多肽 核糖体 mRNA”复合物将肽库构建在多核糖体上, 借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。[13]1997年，Hanes 和Plukthun 等在此基础上对该技术加以完善和改良，正式建立了这种体外筛选技术。[14]这项技术的基本原理：首先使用PCR 技术扩增目的基因DNA 文库，然后加入启动子、核糖体结合位点和茎环，并放在无细胞翻译系统中进行孵育，并且形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体,最后用免疫学检测方法反复筛选,筛选出感兴趣的核糖体复合体，再通过RT-PCR 扩增，经过多次循环过程，最终筛选出高亲和力、库容量大、特异性强的目标分子。转基因小鼠制备人源性抗体和噬菌体抗体库技术有一些共同的缺点。例如在抗体分子定向进化时除了表型筛选和基因突变之间的转换很繁琐之外，库容量也受到了限制；抗体库进行构建时，细菌转化是必经之路，因此抗体库的容量将会受到转化效率的限制等缺点。由于此技术是一个完全在体外进行转化和筛选的过程,其中的每一步包括所有的复制、扩增、转录、筛选均在体外完成，因此可以构建超大容量的库容，也可以联合使用一些特殊的PCR 技术。利用核糖体展示技术可以获得高特异性、高亲和力的抗体。

六、结论及讨论

随着基因工程技术的日益成熟，人—鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源性单克隆抗体应运而生。这些技术十分有效地解决了鼠源性问题，基本消除对抗体的排斥反应。尽管单克隆抗体已经取得了很大的进展，但是仍然还存在很多需要解决的问题：如何寻求新的分子靶点，提高单抗导向的特异性。因此对异源性单抗进行改造以及人源单抗的研制成为单抗研究的重要方向。相信随着科学技术的迅猛发展，单克隆抗体势必为全世界人们带来巨大的福音。

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