大豆酯酶的筛选及对有机磷农药检测效果的研究

邵佳甲

（长春职业技术学院，吉林 长春130118）

目前，全球范围内农药污染广泛，人们对农药残留的检测技术提出了更高要求，需要快速、可靠、灵敏的农药检测技术来进行日常监测。在众多快速检测方法之中，应用最为广泛的为以乙酰胆碱酯酶做酶源做成的试纸条进行检测。但乙酰胆碱酯酶属于动物酯酶，动物酯酶不容易取材，且保存困难[1]，同时价格昂贵。然而植物酯酶与动物酯酶存在相似的敏感性[2]，并且取材广泛，价格低廉，且保存期较长，有较高的研究价值。[3]

本文选择大豆作为研究对象，大豆与其他品种相比酯酶含量较高。[4]但不同品种的大豆酯酶含量不同，因此本文筛选出酯酶含量较高的品种并建立了大豆酯酶和8 种有机磷农药的线性关系，确定了最低检测限。

一、材料与方法

1.供试材料

大豆：26 种大豆购自于吉林农业大学种子中心。

主要试剂：市售乐果农药，市售敌百虫农药，市售敌敌畏农药，市售氧乐果农药，市售久效磷农药，市售甲胺磷农药，市售二嗪磷农药，市售对硫磷农药。

试剂：无水乙醇（分析纯），磷酸二氢钠，a－乙酸萘酯，磷酸氢二钠，固蓝B 盐。

仪器：722分光光度计（上海奥普博仪器有限公司）；磁力搅拌器（金坛市富华仪器有限公司）；离心机（Sigma公司）；恒温水浴（北京国华医疗器械厂）；多功能粉碎机（天津市泰斯特有限公司）。

2.试验方法

（1）制备大豆酯酶：把大豆用多功能粉碎机粉碎碎，用0.3 mol L 1 pH=7.0 的磷酸缓冲液作提取液，取粉碎后的大豆粉浸泡在磷酸缓冲液中，按质量比1∶5 进行混合，用磁力搅拌器进行30min 搅拌提取，放置4℃冰箱中提取12 小时，然后将溶液离心10min（5000r/min），取上清液便是大豆酯酶粗酶液。[5]

（2）底物溶液的制备：把100mg a 乙酸萘酯溶解于无水乙醇80mL 中。

（3）制备显色试剂：取100mL 蒸馏水，将25mg 固蓝B 盐溶于其中。

（4）大豆酯酶含量的测定：在各试管里分别加入制备好的酶液0.1ml，以及pH值为7.5的磷酸缓冲液1.9mL，底物0.1mL，振荡混匀，然后将试管放置在30℃恒温水浴锅中保温10min，10min 后马上取出，将0.9mL 显色剂添加溶液定容至10mL，将此溶液放置在30℃水浴锅中，进行保温10min，然后在722 分光光度计下于520nm进行测定。

（5）抑制方程的建立：配制浓度分别为100mg／L、10mg／L、5mg／L、lmg／L、0．5mg／L、0．1mg／L、0．05mg／L、0．01mg／L、0．001mg／L 的有机磷农药。同时替换步骤1.2.4 中的磷酸缓冲液，将缓冲液换为不同浓度的农药，然后按（4）的步骤测定吸光值。

（6）对不同农药检测限的确定：以仪器可以检测到的最小农药浓度作为大豆酯酶对农药的最低检测限。

二、结果与分析

1.比较不同品种大豆酯酶的吸光值

选取26 种吉林省常见大豆品种按以上步骤处理，测定相应的吸光值，吸光值越大，酶活性越高。[6]吸光度比较见表1。对表1 中数据进行分析得出不同品种大豆总酯酶含量也不相同。

表1 不同品种大豆酯酶的吸光值比较

适合农药检测的，总酯酶含量较高的品种为：通农10、吉林36，长农16，吉农14，吉农6，吉农16 等。对于这些品种可以对其进行进一步研究。不适合进行农药检测的品种，总酯酶含量则较低的分别是：吉丰1，吉林35，吉林50，吉林78 等。根据以上数据选择通农10 进行有机磷类农药检测使用，从而进一步研究有机磷类农药和大豆酯酶之间的作用关系。

2.不同浓度农药对大豆酯酶的抑制效果比较

将敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、二嗪磷、对硫磷、毒死蜱、辛硫磷分别稀释至以下几种浓度100mg/L，10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L.

然后按照上面所叙述方法进行吸光值测定，通过计算数据计算农药对酶的抑制率，制作有机磷农药浓度对数与抑制率之间的对数曲线（如图1），对数方程的斜率能反映出大豆酯酶对有机磷农药的灵敏度。

对图表进行分析得出，大豆酯酶对不同农药的灵敏度不同，灵敏度高低依次为久效磷，甲胺磷，对硫磷、敌敌畏、敌百虫、二嗪磷、氧乐果，其中毒死蜱的灵敏度最差。

图1 不同农药的抑制曲线

3.有机磷农药的抑制反应方程和检测限

抑制率I=A 未抑制 A 抑制/A 未抑制×100%

以抑制率I 为X 轴，抑制剂浓度的对数值为Y 轴，可以用数值方法拟合出一条抑制率与农药浓度对数值的抑制方程。从方程中我们能更加直观地分析出几种农药和大豆酯酶之间的抑制关系，而抑制曲线的斜率有效地展示了有机磷农药对所用大豆酯酶的抑制程度[7]，斜率越大对大豆酯酶的抑制率越强，灵敏度越高。

农药曲线方程相关系数最低检测限（ppm）Pesticideequationscoefficient correlationlimit of detection：

久效磷y=22.505x+37.595R2=0.9860.05 Monocrotophos，甲胺磷y=20.181x+35.644R2=0.9940.05Acephatemet，对硫磷 y = 16.389x + 28.478R2 = 0.99440.05Parathion，敌敌畏 y = 11.527x + 56.412R2 =0.99050.05Panaplate，敌百虫y=9.760x+37.384R2=0.98010.05Trichlorphon，二嗪磷y=9.4009x+20.107R2=0.99150.05Diazinon，氧乐果y=3.3331x+24.153R2=0.98280.1Omethoate，毒死蜱y=2.5026x+17.196R2=0.98120.1Durshan。

表2 有机磷农药酶抑制反应方程

对表2 进行分析，能更好地确定大豆酯酶和各农药灵敏度的关系，具体检测灵敏度由强到弱顺序为：久效磷＞甲胺磷＞对硫磷＞敌敌畏＞敌百虫＞二嗪磷＞氧乐果＞毒死蜱。

大豆酯酶对8 种有机磷类农药的最低检测限试验结果见表2，对久效磷甲胺磷、对硫磷、敌敌畏、敌百虫、二嗪磷的最低检测限为0.05ppm，而氧乐果和毒死蜱分别为0.1 ppm。可见对此8 种农药的最低检测限均低于有机磷农药残留检测的最低限值要求。因此大豆酯酶可以作为有机磷农药快速检测的一种手段。

三、结论

1.通过对26 种大豆种子中的总酯酶含量的比较，筛选出通农10、吉林36，长农16，吉农14，吉农6，吉农16 等作为有机磷类农药残留检测的适宜酶源，可以在有机磷农药检测方面应用。

2.大豆酯酶对有机磷类农药有较好的灵敏性，最低检测线能够达到检测要求，适宜在农药检测方面应用。

3.本试验研究了有机磷农药—大豆酯酶的作用关系，确定了相关的曲线特征及8 个酶抑制方程，表明了大豆酯酶对市场上常用的8 种农药有较好的灵敏性，为用酶抑制法进行有机磷农药的残留分析提供了参考。

4.大豆酯酶检测方法具有操作方便、快速、灵敏、廉价以及适于非专业人员现场快速测定的优点，更适应市场的需要。

[1]周艳丽，李建科，温艳霞.用于农药检测的大豆酯酶的纯化分离[J].大豆科学，2007，（6）.

[2]韩承辉，谷巍，王乃岩，等.快速测定水中有机磷农药方法的研究[J].环境化学，2000，19（2）：187.

[3]张宁.两种酶快速检测有机磷农药残留条件优化研究[J].江苏农业科学，2006，（1）：135-137.

[4]温艳霞，李建科.有机磷农残检测用植物酯酶的研究[J].食品科学，2006，27（4）：123-125.

[5]Baker J E，Fabrick J A，Zhu K Y.Characterization of esterases in malathion—resistant and susceptible strains of the pteromalid parasitoid anisopteromalus calandrae[J]．Insect Biochemistry and Molecular Biology，1998，28：l039-l050．

[6]黄保宏，姚垠.用于检测农药残留的植物酯酶的选择[J].安徽技术师范学院学报，2004，18（2）：15-l7.

[7]阮长青，杨娟，贾伟.有机磷农药与小麦酯酶作用关系研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2006，18（1）：61-62.