猪线粒体DNA研究应用进展

于 萍，曹 婷，施力光，刘雅芳，张立岭，侯冠彧*

(1.海南大学 农学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)

学科动态

猪线粒体DNA研究应用进展

于 萍1，曹 婷2，施力光2，刘雅芳1，张立岭1，侯冠彧2*

(1.海南大学 农学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737)

线粒体DNA是分子生物学研究中的重要分子标记之一，目前在进化遗传学、动物生产性能及医学等多个领域展开研究并取得相关成果。论文简要阐述了猪线粒体DNA的基本组成和特征、研究方法及研究进展概况，并对其研究前景进行了展望，期望对猪线粒体DNA的相关研究提供一定的理论依据和参考。

猪；线粒体DNA；分子标记；研究进展

线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是动物体内唯一存在的核外遗传物质，母系遗传，具有相对恒定且不同于核DNA的生物信息量。自20世纪60年代Nass等[1]首次用电子显微镜直接观察到线粒体内细丝状的DNA以来，与线粒体DNA相关的研究工作迅速展开，现已成为分子生物学研究中的重要分子标记，为进化遗传学、疾病诊断、动物生产性能等研究提供了分子学依据。猪是世界肉产品的主要来源，作为世界重要家畜之一，其线粒体DNA的研究在揭示世界范围内家猪的起源和分类，指导育种工作科学合理地开展，提高生产性能以及促进猪线粒体疾病模型的构建等方面有着重要的意义和广阔的发展前景。本文着重对这方面的研究概况进行论述，旨在为猪的分子生物学方面研究提供一些有益的资料，以期对其物种的保护及合理利用有所帮助。

1 猪线粒体DNA

线粒体是真核生物细胞内基本且重要的自主性细胞器,它通过氧化磷酸化为真核细胞提供超过95%的能量，并参与一些重要的代谢途径，发挥着细胞凋亡、信号转导调控等生化功能。mtDNA是真核生物体内唯一存在的核外遗传物质，呈共价、闭合、环状的双链DNA分子结构，合成一些参与氧化磷酸化反应的蛋白质组分。mtDNA呈裸露状态，缺乏组蛋白保护，同时，由于其损伤修复机制不完善又直接暴露于高活性氧环境中，从而具有高突变特性[2]。研究表明，各种生物的线粒体DNA大小不一,但猪线粒体基因组十分保守,大小约为16.5 kb。

猪线粒体DNA分子根据碱基密度不同分为重链(H)和轻链(L)，在线粒体基因组中含有22个tRNA基因，2个rRNA基因(12SrRNA，16SrRNA),13个mRNA,D-Loop区和轻链复制起始区。13个mRNA包括细胞色素b基因(Cyt b)、细胞色素C氧化酶的3个亚基基因(COⅠ，COⅡ和COⅢ)、ATP酶复合体2个亚基基因(ATPase6，ATPase8)、NADH氧化还原酶的7个亚基基因(ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6)，其中ND1、ND4、ND5、Cyt b和COⅠ为主要的5个呼吸基因，后两者在所有已发现的线粒体基因组中都被发现。D-Loop区位于tRNApro和tRNAphe之间，因不编码基因，其产生的突变可以不断地得到积累而对线粒体的功能不产生影响，因此具有更大进化速率。猪线粒体DNA的基因排列极为紧密，编码结构相对稳定，编码效率高，具有相对恒定的信息量，其主要遗传特性为：(1)严格的母系遗传，可用于分析遗传事件中母本对遗传进化的贡献；(2)序列差异在物种内甚至同一群体中的个体间存在，为生物分子学方面的研究提供了依据；(3)与核基因组相比，突变率高，适用于研究较近期的遗传事件；(4)遗传自主性：能进行自我复制并转录生成mRNA、tRNA和rRNA，还可以编码合成一些维持结构和功能所必需的蛋白质。

2 猪线粒体DNA的检测方法

猪线粒体DNA的研究主要集中在序列多态性上，其主要表现形式是点突变，多数为碱基转换，少数是颠换，还有部分碱基的插入或缺失等。因此，理论上检测点突变和其他序列变异的技术都可用于线粒体DNA的序列分析[3]，如限制性片段长度多态性分析、寡核苷酸连接分析、异源双链分析、变性梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、等位基因序列特异性PCR等。其中，在猪线粒体DNA研究中主要应用的是PCR-RFLP技术和DNA测序技术。

2.1 PCR-RFLP技术

PCR-RFLP是基于PCR的限制性片段长度多态性分析技术，试验过程中先用两个特定引物扩增基因组DNA，然后用适当的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后电泳检测多态性。此方法可以根据限制性片段或位点的差异，计算种间的遗传距离，进一步构建分子聚类图或分子系统树，可构建出群体或物种间的系统分化、系统发育情况或过程[3]。该技术多应用于肉产品来源鉴定分析，具有易操作、经济和检测速度快等优点。Haider等[4]设计了扩增牛、鸡、火鸡、羊、猪、水牛、骆驼、驴生肉中COⅠ基因的核苷酸引物，使用PCR-RFLP技术对其进行鉴别，结果表明此方法可以对肉源进行快速、准确的分析，操作简单、快捷，可以在实验室普遍应用。

2.2 DNA测序技术

DNA测序是线粒体DNA序列多态性检测的最常用的方法之一，至今共发展有三代测序技术，分别为Sanger技术(链终止测序技术)、二代DNA测序(Next-generation Sequencing,NGS)技术和单分子测序技术。第一代DNA测序技术在猪线粒体DNA相关研究中被广泛的应用，原理是将缺乏延伸所需的3-OH基团的双脱氧核苷三酸(ddNTP)作为链终止试剂，使用DNA聚合酶对引物进行延伸从而产生一系列不同长度的DNA片段，再进行DNA片段的分离和分析。Xu等[5-7]设计了24对引物，使用第一代测序技术获得了宁乡猪、桃园黑猪、黔邵花猪等线粒体基因组的全序列信息，并对其组成和特点进行了分析。第一代测序技术优点是阅读长度长、灵敏度高、结果准确且适用于毛发等无核生物检验材料。缺点是成本及仪器昂贵、操作复杂、速度慢等。NGS技术主要包括三种测序平台，即454、Solexa和SOLiD[8]。NGS技术的优点是成本低，高度并行化(可同时检测大量DNA分子序列)，通量高且速度快，但读长短是NGS最大的缺点。单分子测序技术主要有两个研究方向，分别为单分子合成测序技术和纳米孔测序技术,其有望解决NGS技术中出现的问题并进一步降低成本。第二代和第三代测序技术主要服务于全基因组的测序工作，目前已成为研究热点，随着应用领域不断扩展，Goedbloed等[9]认为，全基因组SNP分析是量化自然种群近期杂交情况的具有发展前景的工具之一。

3 猪线粒体DNA研究的应用

猪线粒体DNA研究的应用涉及到了包括进化遗传学、生产性能关联性、动物源性产品检测等在内的多个领域，研究对象主要为线粒体基因组全序列、D-Loop区序列，Cytb基因、COⅠ基因和rRNAs基因研究也有相关的报道。

3.1 进化遗传学研究中的应用

动物线粒体DNA现已成为动物进化遗传学研究中一个重要的分子标记。该研究方法主要是以线粒体DNA的多态性为基础，通过测定序列和限制性内切酶等方法对其进行分析，基本研究内容为：目的线粒体DNA片段的获取→数据分析→比较构建图谱，计算遗传距离，得到系统树→物种起源、群体遗传结构中所发生的遗传差异及亲缘关系等内容的分析。

3.1.1 猪种起源和遗传分化研究 猪的起源和遗传分化一直受研究者关注，针对这一问题的研究不仅有利于对猪种资源的合理保护和利用，还对进一步了解人类的迁徙、进化和文化的形成等具有重要的意义。随着研究技术的完善、样品数量的增加以及地理范围的扩大，基于线粒体DNA的猪的起源分化与遗传多样性研究得到了进一步的发展。

世界范围的家猪起源目前比较统一的观点为欧亚大陆起源且欧洲和亚洲为独立的驯化中心，主要研究对象为线粒体DNA D-Loop区序列和全序列。Larson等[10]分析了世界范围内的686个野猪和家猪个体的D-Loop区序列并进行了全球范围的野猪系统地理学研究，认为家猪的起源在欧亚大陆，有多个独立的驯化中心。Fang等[11]通过对部分欧洲和亚洲猪种D-Loop区的序列分析验证了欧洲和亚洲是两个独立的驯化中心这一观点，在欧洲猪中发现的亚洲猪单倍型与中国南方猪种相似或相同，欧洲和亚洲猪种经历过数量扩张。Luetkemeier等[12]通过对欧洲、亚洲的8个家猪品种及野猪的21个微卫星标记和线粒体D-Loop研究分析表明：欧洲和亚洲猪种完全独立，亚洲种群由分别以二脸花猪和梅山猪、兰屿猪、亚洲野猪为代表的三个群体组成；亚洲家猪由多个祖先起源演化而来，而欧洲家猪起源于一个祖先血统。Fernández等[13]基于32个欧洲和亚洲家猪及野猪基本完整的线粒DNA序列分析，获得其分歧时间的一个精确的计算，研究估计亚洲和欧洲猪在746,000年前分化，欧洲家猪和野猪分歧时间估计为8500年前。

中国地方猪种资源丰富，起源和遗传分化研究对揭示其表型多样性的本质、了解基因库资源状况及育种工作的指导具有重要意义。中国具有丰富的小型猪种资源，其起源和分化研究工作得以不同程度的开展。岳敏等[14]对五指山小型猪、巴马小型猪和贵州香猪进行线粒体DNA控制区的比较研究，结果表明三种小型猪种内和种间多态性贫乏，五指山猪和巴马小型猪亲缘关系较近。李洪涛等[15]对西藏小型猪Cyt b基因序列和氨基酸序列进行分析，结合欧洲品种猪和中国几个地方猪种的相关信息，分析结果显示只有部分西藏小型猪与巴马小型猪、贵州香猪、五指山猪有很近的亲缘关系，同时证实西藏小型猪群体内存在遗传分化。Yang等[16]广泛采集藏区和云南地方猪种，完成了近2000个亚洲家猪和野猪样本的线粒体高变区序列分析，并在此基础上揭示了青藏高原和东南亚群岛两个新的家猪起源地，得出了藏猪本地起源的结论。其他地方猪品种的相关研究也在不断的进行，为中国猪种基因库资源提供了大量的数据。刘靖闻等[17]对135头蕨麻猪的线粒体DNA D-Loop区序列进行分析，结果表明蕨麻猪具有2个母系起源，与东南沿海野猪有较近的亲缘关系，没有发现东亚与东南亚野猪对蕨麻猪的起源有贡献的证据。先前的研究表明东亚有两个主要的家猪传播路线：一个是从湄公河流域经过长江上游地区到黄河中上游地区；另一个为从长江中下游地区到黄河下游地区最后到达中国的东北地区。Jin等[18]分析了主要来自四川和西藏高原的513个猪样本线粒体DNA高变区序列和下载得到的1394条亚洲家猪、野猪序列信息，结果表明，分布于长江上游地区的家猪由原地驯化而来。

在猪起源和遗传分化研究过程中，不断出现新的研究成果和结论，与前人的研究成果存在一定的差异。这一现象的出现主要是由研究中样本数量较少、研究范围局限等引起的，研究者需要通过增加研究中猪品种数量，扩大样本的数量和研究范围来解决这一问题，从而对猪线粒体DNA基因库进行进一步的补充。同时，常染色体基因组研究、Y染色体DNA标记研究及历史学、考古学、体型外貌、地理分布等方面信息的联合应用将有助于彻底的解答猪起源进化之谜。Krause-Kyora等[19]采用多学科研究的方法研究西北欧中石器时代采猎者对家猪的使用情况，对63个古猪标本进行古线粒体DNA和核DNA(MC1R基因)测序分析以及传统的和几何学的形态测定(臼齿的大小和形状)，表明Ertebølle的采猎者获得了拥有近东和欧洲线粒体DNA血统不同大小、不同毛色的家猪，同时证明了家猪在这一地区出现的时间与之前的研究结果相比早500年。

3.1.2 猪品种鉴定和分类学研究 传统的品种鉴定和分类学研究主要是根据各种家猪的体型外貌、地理分布和生态类型、历史及考古资料，需要一定的专业知识和识别能力。随着生物化学和现代遗传学技术的发展，目前，线粒体DNA作为一个可靠的母性遗传标记已应用于猪品种鉴定和分类学研究。

Lucchini等[20]扩增了D-Loop区上两个片段，通过分子学和形态学测定技术对马来西亚、印度尼西亚和菲律宾的一些野猪种群进行了分类学研究，结果表明东南亚存在两个主要自上新世开始分化的进化支，一个进化支包括分布在菲律宾和苏拉威西岛的野猪种群；另一个进化枝包括印尼和马来西亚的须野猪及广泛分布的欧洲野猪。同时发现，马来半岛的须野猪与婆罗洲的群体有较近亲缘关系，但是与苏门答腊岛的群体种类不同，它们被认为属于不同的亚种。孙俊丽等[21]测定了陆川猪17个个体线粒体DNA D-Loop高变区序列，结合已报道的中国地方猪种的线粒体DNA D-Loop序列进行分析，结果发现陆川猪和属于华中型的宁乡猪、大花白猪有很近的遗传关系，但与传统上同属华南型的香猪和滇南小耳猪的遗传关系较远，这与传统的分类方法不一致。Lopez等[22]使用线粒体DNA D-Loop区序列对北昆士兰的35野生猪进行血统认定，系统发育分析显示了两个不同的线粒体DNA进化枝，分别代表亚洲家猪猪种和欧洲猪种。Gupta等[23]研究表明，Cyt b基因中421 bp片段的DNA序列可以对印度野猪和家猪这两个亚种进行区分。通过对NJ树的分析表明印度家猪不是印度野猪的后代，却与欧洲和亚洲野猪有99%的相似度，这也与家猪的欧亚起源观点相符。线粒体DNA的研究为猪品种的鉴定和种群的分类提供了分子学依据，弥补了传统方法不确定性和不准确性的缺点，成为了一个十分有力的辅助手段。

3.1.3 杂交渐渗现象的研究 杂交渐渗泛指两个物种或种群的基因在基因库间单向或者双向的流动，它是生物进化的重要动力，也是物种进化选择上的潜在资源，可参与新种的形成。由于线粒体DNA为母性遗传，渗入后不易因重组或漂变而从群体中消失，因此可用来进行猪种间杂交渐渗现象的分析。

Okumura等[24]对取自8个欧美品种、6个东亚品种的159头家猪以及164个日本猪、5个欧洲野猪的非编码线粒体DNA进行系统发育分析，研究表明欧洲猪种内出现广泛的亚洲国内猪种的渐渗现象。Goedbloed等[9]利用全基因组SNP技术对有代表性的西北欧家猪和野猪的样品进行分析，并结合线粒体DNA D-Loop区部分序列分析结果表明，基因渐渗现象已经出现，这可能是由已经杂化养殖的野猪的逃跑或放归造成的，家猪遗传基因渗入到西北欧野猪群这一现象比预期的更常见且时间较近。Frantz等[25]在西英格兰迪恩森林里的一个野猪群遗传状态评估过程中发现，在野猪的线粒体控制区中存在高频率的家猪来源的等位基因，推测家猪和英格兰野猪在过去存在过杂交。随着研究的不断开展，杂交渐渗现象在不同地区的野猪或家猪群体中被确认，针对地方珍贵猪种基因库的合理保护工作亟待进行。

3.2 猪线粒体DNA与生产性能关系的研究

Santos等[26]分别对小鼠、猪、人的研究表明，线粒体DNA的拷贝数可能是评价一个卵母细胞能力的指标。在卵母细胞成熟过程中，线粒体DNA拷贝数越高，线粒体活性越高，卵母细胞成熟越好，受精能力越强，胚胎发育潜能越高。Wai等[27]通过对小鼠的精子和卵母细胞线粒体DNA拷贝数的研究认为，成熟卵母细胞内的高线粒体DNA拷贝数是一个遗传机制，从而有利于在线粒体生成和线粒体DNA复制前，对植入的后期胚胎细胞进行线粒体和线粒体DNA分配，但是线粒体DNA拷贝数的减量调节对于动物精子功能十分重要。

目前的研究结果可推断出线粒体DNA与猪的繁殖性能有一定的关系，但尚未有明确的报道，其机理有待进一步研究。

3.3 动物源性产品检测中的应用

动物源性产品检测与经济、宗教和公共健康问题密切相关，猪线粒体DNA在此方面得到了有效的应用，效果显著。Haider等[4]使用PCR-RFLP技术对牛、鸡、火鸡、羊、猪、水牛、骆驼、驴生肉中扩增获得的COⅠ基因进行鉴别，结果表明Hpa II是检测以上物种生肉中COⅠ基因多态性的最适宜的限制性内切酶，可准确、快速的对不同来源生肉进行辨别。范丽丽等[28]以猪线粒体Cytb基因序列为靶位点设计引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，建立猪源性成分快速且准确的检测方法。

3.4 医学方面的研究

李洪涛等[29]进行了实验用西藏小型猪线粒体DNA控制区碱基序列变异分化类型分析和血液生理生化指标差异的比较，结果表明西藏小型猪分为两个类群，两个群体之间红细胞数存在明显差异。这一研究结果揭示了猪线粒体DNA与其红细胞数间存在一定的关联性，为培育医学用实验小型猪提供了一定的分子学依据。Kwak等[30]在使用克隆猪模型进行的皮肤移植手术中检测线粒体DNA HV-1区的抗原性，结果表明线粒体DNA HV-1区的多态性不诱发猪的皮肤移植排斥反应，在此研究基础上，作者认为在器官移植手术中，基于线粒体DNA多态性的免疫原性研究具有重大意义。

4 前景与展望

猪线粒体DNA已得到广泛研究与应用，但尚有相关领域还未涉及，亟需研究者进一步的开发和验证。DNA条形码(DNA barcoding)技术是利用一段短的标准DNA序列来鉴别种群，确定种群间的亲缘关系远近，可以为动物保护提供一些非常有用的信息，有助于确定动物保护的基本单元[31]。线粒体DNA片段是DNA条形码的一个理想选择，当前，COⅠ、Cyt b、ND1等线粒体DNA已被作为DNA条形码在鱼类、两栖类、蚌类、灵长类等鉴定工作中应用，但猪DNA条形码的研究还未见报道。我国猪种资源丰富，猪DNA条形码研究具有重要的意义和广阔的发展空间。

作为重要的肉用产品来源，猪的生产性能无疑是研究的热点和重点。线粒体是动物能量代谢发生的主要场所，理论上，线粒体DNA的突变可以通过编码蛋白的改变从而对生产性能产生一定的影响，虽然已有猪线粒体DNA对卵母细胞作用的相关报道，但直接对猪生产性能与线粒体DNA关联性及机理研究还未进行，有待进一步探索。

线粒体DNA突变可导致生物体内某些蛋白功能的改变，从而影响其正常机能。线粒体疾病便是线粒体突变导致的一类临床异质性疾病，通常是由氧化磷酸化缺陷导致的细胞能量缺失引起，目前，超过250个致病的线粒体DNA突变被确认[32]。医学研究中使用的线粒体疾病模型有转线粒体胞质、酵母菌和小鼠，试验用小型猪还未用于线粒体疾病的研究。

综上所述，猪线粒体DNA在分子生物学方面已得到了较为深入的研究和广泛的应用，但仍具有更广阔的发展空间。我国有丰富的小型猪资源，其中，藏猪、五指山猪是较为理想的医学研究模型，对其线粒体DNA深入系统的研究将为培育医用实验小型猪提供分子遗传学基础，从而推进线粒体疾病发生机理、治疗方法等方面的研究，具有广阔的应用前景。

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StudyandApplicationProgressofMitochondrialDNAinPigBreeds

YU Ping1,CAO Ting2,SHI Li-guang2,LIU Ya-fang1,ZHANG Li-ling1,HOU Guan-yu2*

(1.CollageofAgriculture,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China；2.TropicalCroposGeneticResourceInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou,Hainan571737,China)

Mitochondrial DNA(mtDNA)is one of the most important molecular markers in the studies of molecular biology.Study of mtDNA on evolutionary genetics,animal performance and medical science has been conducted and the related results have been concluded.In this paper,the fundamental structure and genetic characteristics of the pig's mtDNA,research methods and the overview of research advances were presented and the research trends were discussed aiming at preparing certain theoretical basis and reference for further study on the mtDNA in pig breeds.

pig; mitochondrial DNA; molecular marker; research advances

2014-02-24，

2014-04-10

家养动物种质资源平台运行服务费；中央级公益性科研院所基本业务费(1630032013020)

于 萍(1988-)，女，山东烟台人，硕士研究生。研究方向：家畜遗传资源。E-mail：yuping198807@126.com

*[通讯作者]侯冠彧(1975-)，男，内蒙古通辽人，博士。副研究员，研究方向：家畜遗传资源。E-mail：guanyuhou@126.com

S811.6

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1005-5228(2014)07-0001-06