8周低强度有氧运动可能通过Toll-4/NF-κB途径提高缓解期炎症性肠病疗效

王晨宇

8周低强度有氧运动可能通过Toll-4/NF-κB途径提高缓解期炎症性肠病疗效

王晨宇1，2

目的：观察8周低强度有氧运动对缓解期炎症性肠病（IBD）患者临床疗效的影响，并探讨其可能机制。方法：29名缓解期IBD患者分为运动组（n=14）和对照组（n=15）。运动组进行8周有氧运动，对照组保持日常习惯。检测8周治疗前后，Toll-4/NF-κB途径活性并对临床疗效进行评价。结果：与试验前比较，运动组试验后血浆IL-6和TNF-α含量，外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白，NF-κB p65 mRNA以及核NF-κB p65蛋白水平均下降（P<0.01）；对照组各指标的差异无统计学意义（P>0.05）。试验后，运动组总有效率高于对照组（P<0.05），复发率低于对照组（P<0.01），不良反应率2组间的差异无统计学意义（P>0.05）。结论：缓解期IBD患者进行低强度有氧运动可显著提高临床疗效，其机制可能与抑制TLR4-NF-κB信号通路并下调炎症因子表达有关。

有氧运动；炎症性肠病；缓解期；运动能力；Toll样受体4；核因子-κB

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，简称IBD）是一种原因不明的慢性非特异性肠道炎性疾病，包括克罗恩病（Crohn's disease，简称CD）和溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，简称UC），是我国消化系统常见病[1-2]，具有病程长、易反复发作的特点。IBD既给病人带来身体上的痛苦，又增加病人的经济负担和精神压力，严重影响了患者的健康及生活质量。IBD虽为良性病变，但其发病机制仍不清楚，尚无有效的根治手段，临床治疗（药物或手术）的目的主要是减轻患者的症状，控制复发，但其副作用大，效果不佳。因此，寻找作用持久且副作用较小的治疗手段是亟待解决的问题。

缺乏运动是IBD的发病原因之一[3]，以往研究[4-5]也发现，IBD患者的运动能力明显下降。虽然规律运动有益身心健康，对各种疾病特别是慢性病具有预防甚至治疗作用，但是，有关规律有氧运动对IBD患者的临床疗效及机制研究至今尚未见报道。本研究以缓解期IBD患者为受试对象，观察8周低强度有氧运动对临床疗效、运动能力以及外周血单核细胞Toll样受体4（Toll-like receptor 4，简称TLR4）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）基因表达的影响，为制定特异性运动处方提供依据。

1 研究对象和方法

1.1 研究对象

招募郑州市二七区经确诊的IBD患者，纳入标准包括：（1）电子结肠镜和病理确诊，符合2007年5月济南全国炎症性肠病研讨会修订的《对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》中的诊断标准[6]；（2）经规则治疗进入缓解期的患者，缓解期的诊断标准为症状消失，伴内镜复查见粘膜愈合（肠粘膜正常或无活动性炎症）；（3）年龄在18～60岁。排除标准包括：（1）感染性肠炎、放射性肠炎及肠癌患者；（2）半年内有规律运动的患者；（3）合并有心脑、血管、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病者。符合标准的受试者共计32名，随机分为运动组和对照组。运动组进行8周有氧运动干预，对照组保持日常生活习惯不变。所有受试者在试验期间按照医生处方常规服用抗IBD药物，不得随意更换药物的种类和剂量（每天进行记录）。

试验过程中，由于各种原因退出本试验的受试者为3人（对照组1人，试验组2人），因此，最终的样本量为运动组14人，对照组15人，受试者的基线特征见表1。2组受试者人体测量学指标、使用药物情况、血液动力学指标和运动能力指标等基线变量之间的差异均无统计学意义（P>0.05），组间具有可比性。

表1 受试者基线特征Table1 Baseline characteristic of subjects

1.2 整体试验流程

利用病历、问卷调查及肠镜检查等方法选取IBD患者。某日清晨肘正中静脉取血5 mL，测定血浆白细胞介素-6（interleukin-6，简称IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，简称TNF-α）含量以及单核细胞TLR4和NF-κB基因表达。随后，利用递增负荷运动试验测定最大摄氧量（maximal oxygen uptake，简称VO2max）、最大功率和力竭时间。休息2天后，运动组开始进行8周有氧运动（对照组保持日常生活习惯）。试验结束后第2天再次取血测定基因表达和运动能力，第3天进行肠镜检查以评价干预效果，并随访3个月，对病情复发进行评定。

1.3 血浆及外周血单核细胞提取

所有受试者在试验前24 h内清淡饮食、避免剧烈运动。清晨（6：00-7：00）空腹状态下，肘正中静脉取血5 mL，置于EDTA抗凝管中。其中，1 mL全血4℃3 000转/min离心15 min，分离血浆，置-20℃冰箱保存，待测血浆IL-6和TNF-α含量。另外4mL采用Fieoll密度梯度离心法提取外周血单核细胞，加入1 μg/mL LPS，悬浮于含10%胎牛血清的PRMI 1640培养基中，置入含5%CO2、37℃培养箱中进行6 h细胞培养。

1.4 血浆IL-6和TNF-α含量的测定

采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定，仪器为SPECTRmax PLUS型酶标仪（美国Molecular device公司），试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。严格按照试剂盒说明进行操作，每个指标设置双孔，取均值，单位均为ng/L。

1.5 实时荧光定量PCR测定TLR4和NF-κB p65 mRNA表达

取1 mL细胞悬液离心，使用Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司）抽提总RNA，用逆转录试剂盒并参照说明书进行逆转录反应，生成cDNA。各基因的引物序列见表2。实时荧光定量PCR采用10 μL反应体系：引物各0.4 μL，cDNA 1.5 μL，双蒸水7.7 μL。反应参数：预变性93℃2 min，93℃45 s，58℃30 s，72℃60 s，共30个循环。记录循环数（Ct值），基因表达的扩增倍数以2-ΔCt表示，ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin，计算相对表达量（对照组试验前的倍数）。

表2 引物序列Table2 Primer sequences

1.6 Western Blot法检测TLR4、总NF-κB p65和核NF-κB p65蛋白表达

取1 mL细胞悬液离心后分别提取总蛋白和核蛋白（细胞核提取试剂盒：美国Pierce公司），用BCA法测定蛋白含量。TLR4为跨膜蛋白，故测定总蛋白中的TLR4含量即可（以“TLR4”表示）；由于NF-κB激活后从胞浆入核而发挥作用，因此，需要测定其具有转录活性的亚基p65分别在总蛋白及核蛋白的含量（分别以“总NF-κB p65”和“核NF-κB p65”表示），以明确其是否发生核移位。蛋白样品经15%SDS-PAGE分离转移于PVDF膜，一抗（Santacruz公司）孵育过夜，HRP标记二抗（TBD公司）孵育1 h，ECL显影。采用凝胶系统分析软件扫描各条带灰度值，以β-tubulin为内参蛋白，计算各组条带与对照组试验前的比值，即相对表达量。

1.7 运动能力测试——递增负荷运动试验

用功率自行车（Monark 839E，瑞典）进行递增试验。试验在清晨（7：30-10：00）进行，整个过程在心电监护和2名急诊医生的陪同下进行。先休息10 min，测定安静坐位时的血压和心率，进行10 min准备活动（拉伸与慢跑），并适应性蹬车1 min（无负荷）后进行正式试验。测试方法：起始负荷为30 W，每2 min递增30 W，保持60 r/min的转速。用运动心肺测试系统（Cortex，德国）测定摄氧量（VO2）、CO2呼出量（VCO2）、呼吸交换律（RER）等，用遥测心率表（Polar FT4，芬兰）记录心率，嘱咐受试者在运动中读出主观体力感觉（rating of perceived exertion，简称RPE）。若受试者在心率、血压、心电图、呼吸、主观感觉、客观表现等任一方面出现异常或者受试者主动要求停止试验时，即终止试验，此时的VO2值即为受试者的VO2max，同时记录最大功率与力竭时间。

1.8 运动处方的制定和实施

运动总时间为8周，每周3次，运动强度根据NARULA等[7]的分析结论定为50%～60%VO2max。每次运动程序依次为热身、跑步和整理运动。热身：大肌肉群的拉伸练习和慢跑，约5～ 10 min。跑步：前4周时间为30 min/天，后4周增至60 min，每次运动分2组完成，组间间歇5 min。整个运动过程中对心率进行实时监控（Polar FT4，芬兰），以控制在50%～60%VO2max对应的靶心率范围内。整理运动：主要肌肉群的拉伸训练，每个动作重复15～20次，2组，约5～10 min。

1.9 临床疗效、不良反应及疾病复发评价

将临床疗效分为显效（临床症状消失，结肠镜复查见粘膜大致正常或无活动性炎症）、有效（临床症状基本消失，结肠镜复查见粘膜轻度炎症）和无效（临床症状、结肠镜复查均无改善），总有效率＝（显效例数+有效例数）/样本量×100%[6]。试验过程中，记录不良反应事件，包括类型、发生时间、频率、持续时间、严重程度，不良反应率＝不良反应例数/样本量×100%。随后，对显效及有效病例进行3个月随访以评价疾病复发情况，疾病复发判断标准为：经治疗进入缓解期后，相关临床症状再次出现，并有实验室炎症指标、内镜检查和影像学检查的疾病活动证据，复发率=复发例数/样本量×100%。

1.10 统计学分析

采用SPSS 14.0统计软件进行分析，计数资料（百分构成比）采用卡方检验，计量资料采用T检验（组间比较采用独立样本T检验，组内比较采用配对T检验）。P<0.05表示显著性差异，P< 0.01表示非常显著性差异。

2 结果

2.1 运动能力

与运动前比较，8周有氧运动干预后，运动组安静心率下降（P<0.01），VO2max、最大功率和力竭时间的增加均有统计学意义（P<0.01）；对照组各指标的变化均无统计学意义（P>0.05）（见表3）。

2.2 血浆IL-6和TNF-α含量

试验后，运动组血浆IL-6和TNF-α含量较试验前的降低均有统计学意义（P<0.01），对照组则无明显变化（P>0.05）（见表4）。

表3 试验前后运动能力的变化Table3 Changes of exercise capacity before and after test

表4 试验前后血浆IL-6和TNF-α的变化/ng·L-1Table4 Changes of IL-6 and TNF-α before and after test/ng·L-1

2.3 临床疗效、不良反应及复发率

运动组的总有效率为92.9%，对照组的总有效率为60.0%，2组间的差异有统计学意义（P<0.05）（见表5）。试验期间，运动组出现不良反应者4例（头痛、胃区不适），对照组3例（恶心、腹泻、食欲不振），2组均能耐受，无须停药或停止运动，不良反应率在2组间的差异无统计学意义（P>0.05）（见表6）。对显效及有效病例（运动组13例，对照组11例）进行为期3个月的随访发现，运动组有3例复发，对照组有8例复发，组间比较差异有统计学意义（P<0.01）（见表7）。

表5 2组临床疗效比较Table5 Comparison of clinical curative effect in two groups

表6 2组不良反应比较Table6 Comparison of adverse reaction in two groups

表7 2组复发率比较Table7 Comparison of relapse rate in two groups

2.4 TLR4和NF-κB p65 mRNA

试验后，运动组TLR4和NF-κB p65 mRNA较试验前的下降均有统计学意义（P<0.01），对照组的变化则无统计学意义（P>0.05）（见图1）。

图1 TLR4和NF-κB p65 mRNAFigure1 TLR4 and NF-κB p65 mRNA

2.5 TLR4、总NF-κB p65和核NF-κB p65蛋白

试验后，运动组TLR4和核NF-κB p65蛋白较试验前的下降均有统计学意义（P<0.01），总NF-κB p65蛋白的差异则无统计学意义（P>0.05）；对照组各指标的变化均无统计学意义（P> 0.05）（见图2、图3）。

图2 Western Blot蛋白表达图Figure2 Protein expression graph of Western Blot

图3 TLR4、总NF-κB p65和核NF-κB p65蛋白Figure3 TLR4，total NF-κB p65 and nuclear NF-κB p65 protein

3 讨论

运动与IBD的关联研究较少，为数不多的几项流行病学报道显示[3，8]，久坐少动的生活方式可能是IBD的危险因素，而对体力要求较高的从业人员，IBD的发生率明显低于久坐人群。仅有的2项有关运动治疗IBD的前瞻性研究结论并不一致[9-10]，甚至出现病情加重的报道，可能与患者是否处于缓解期有关。此外，由于大强度运动可引起运动胃肠道综合症（运动员常见）[11-12]，而中低强度运动则可改善胃肠道功能，并降低憩室病、胆石症、便秘和结肠癌等胃肠相关疾病的发生率[13]，说明，运动对胃肠道的影响与运动强度密切相关，而针对IBD患者的运动处方仍未确定。

本研究以缓解期IBD患者为对象，采用低强度（50%～60% VO2max）有氧运动方式，经过8周运动处方干预发现，运动组的总有效率明显高于对照组，3个月随访的复发率低于对照组，而不良反应率在2组间的差异无统计学意义。说明，运动疗法可显著提高IBD的临床疗效，在降低复发风险的同时并未增加患者的不良反应。本研究还发现，8周有氧运动后，患者的运动能力得到提高，即递增负荷试验中的VO2max、最大功率、力竭时间的增加和安静心率的下降均有统计学意义。最近的一项随访研究发现[4]，与其他危险因素相比，体适能低下与IBD死亡率相关性更高，运动能力是IBD患者疾病的强预测因素。在本研究中，由于患者运动能力提高，推测其死亡率将下降，同时生活质量得以改善。由于本研究制定的低强度有氧运动处方安全性高、耐受性好、易于接受、效果作用持久且复发率低，因此可作为缓解期IBD患者维持治疗的有益补充，值得临床推广应用。

IBD的发生与遗传背景、肠道免疫系统异常激活、氧化应激、抗炎与促炎因子表达失衡以及心理应激等因素密切相关[14]，过度炎症反应是IBD发生的主要机制。TNF-α和IL-6是最重要的2种促炎因子，直接参与IBD的病理过程[15-16]。IL-6可诱导细胞间粘附分子的表达，对多种细胞具有促炎作用，并诱导肝组织产生急性反应蛋白。TNF-α与多种细胞因子协同作用，诱导炎症介质产生，促进单核巨噬细胞和中性粒细胞趋化作用，上调内皮细胞粘附分子表达，增加上皮通透性，并抑制上皮细胞的生长等。促炎因子的过表达最终加重粘膜炎症，并促进肠粘膜上皮细胞凋亡[15]，而抗炎治疗则可显著改善患者的症状。本研究中，运动组试验后血浆促炎症因子TNF-α和IL-6含量的降低有统计学意义，说明8周有氧运动下调了炎症因子的过表达。提示，运动可通过抗炎效应在一定程度上起到缓解炎症和治疗IBD的作用。

与本研究结果相似，诸多研究[17]均已阐明运动的抗炎效应，但其具体机制尚未明了，可能机制包括抑制炎症单核细胞的释放、减少内脏脂肪、使免疫细胞构型发生变化等[18]。近期研究指出，TLR4-NF-κB介导的免疫炎症信号通路持续激活及下游炎症因子过表达是IBD最重要的发病机制[19]。TLR4属I型跨膜受体，在肠道粘膜广泛表达，主要参与病原微生物产物的识别及炎症信号的转导。TLR4经MyD88信号途径可激活NF-κB，NF-κB是由p50亚基和p65亚基（关键活性亚基）构成的异源二聚体，是炎症和免疫反应调控过程中的核心转录因子[20]。生理状态下，NF-κB与其抑制蛋白IκB在胞浆中结合，从而抑制NF-κB的核转位，使其处于失活状态。当细胞应激时，IκB被上游的IKK磷酸化而降解，IκB与NF-κB分离，NF-κB激活并转移至胞核内促进众多基因转录。业已证实，对IBD起主要致病作用的促炎症因子IL-6和TNF-α等在转录水平均由NF-κB调控[19]。抑制肠道TLR4-NF-κB信号途径过度激活是治疗IBD的新靶点。肠道活检免疫组化研究证实，IBD时肠粘膜TLR4和NF-κB高表达，而IBD患者外周血单核细胞TLR4和NF-κB表达同步增高[21]，且与血中的促炎因子含量[22]以及病情严重程度[21]高度相关。说明，TLR4-NF-κB信号途径在外周血单核细胞和肠道粘膜细胞具有相似的调控方式。因此，可通过外周血单核细胞基因表达的变化间接反映肠道的变化，以及评价各种干预措施对IBD的疗效，从而避免肠道活检造成的组织损伤。本研究中，运动组外周血单核细胞TLR4 mRNA和蛋白，NF-κB mRNA以及核NF-κB p65蛋白水平较试验前的下调均有统计学意义，而总NF-κB p65蛋白水平的变化则无统计学意义。提示，运动下调TLR4和NF-κB表达的同时抑制了NF-κB核移位，进而减少促炎因子的大量产生，即长期运动可通过抑制TLR4-NF-κB信号途径过度激活对IBD起到缓解和治疗的作用。

4 结论

缓解期IBD进行低强度有氧运动可显著提高临床疗效和运动能力，降低疾病复发率，其机制可能与运动抑制TLR-NF-κB信号通路并下调促炎症因子表达有关。因此，低强度有氧运动可作为缓解期IBD患者维持治疗的有益补充，值得临床推广应用。

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Aerobic Exercise of Eight Weeks Improved Curative Effect on Patients of Inflammatory Bowel Disease with Remission Stage via Toll-Like Receptor 4/NF-Kappa B Signal Pathway

WANG Chenyu1，2
（1.Dept.of PE，Zhengzhou Institute of Aeronautical Industry Management，Zhengzhou 450015，China；2.Post Doctor Station of Sports Science，Fujian Normal University，Fuzhou 350158，China）

Objectives：To observe the effects of 8-week low intensity aerobic exercise on clinical curative effect in patients with remission stage of inflammatory bowel disease（IBD）and investigate the possible mechanism.Methods：29 patients of IBD with remission stage were randomly divided into exercise group（n=14）and control group（n=15）.Subjects of exercise group performed an 8-week aerobic exercise and control group maintained their daily life style. Toll-4/NF-κB pathway activity was measured and curative effect was evaluated after test.Results：Compared with pre-test，plasma IL-6 and TNF-α，TLR4 mRNA and protein，NF-κB p65 mRNA and nuclear NF-κB p65 protein of peripheral blood monocytes downregulated（P<0.01）in exercise group after test；there were no significant difference of all indexes in control group（P>0.05）.Compared with control group，total effective rate of exercise group was higher（P< 0.05），relapse rate was lower（P<0.01），but adverse reaction rate had no statistical difference（P>0.05）.Conclusion：Low intensity aerobic exercise may improve curative effect and reduced relapse rate for patients of IBD with remission stage.The mechanism was related to inhibition of TLRsNF-κB signal pathway and downregulation of gene expression of downstream inflammatory factors.

aerobic exercise；inflammatory bowel disease；remission stage；exercise capacity；TLR4；NF-κB

G 804.5

A

1005-0000（2014）03-259-05

2013-07-16；

2014-03-11；录用日期：2014-03-12

王晨宇（1975-），男，河南淮阳人，博士，副教授，研究方向为运动人体科学。E-mail:wchenyu@126.com。

1.郑州航空工业管理学院体育教学部，河南郑州 450015；2.福建师范大学体育学博士后流动站，福建福州 350158。