运动疲劳可能通过激活海马小胶质细胞介导的神经炎症降低大鼠学习记忆功能

孙丽娜，刘晓莉，乔德才

运动疲劳可能通过激活海马小胶质细胞介导的神经炎症降低大鼠学习记忆功能

孙丽娜1，2，刘晓莉2，乔德才2

目的：观察反复力竭运动对大鼠海马小胶质细胞形态及炎症因子白介素-1β（interleukin 1 beta，简称IL-1β）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis fatctor-alpha，简称TNF-α）和诱导型一氧化氮合酶（inducer type Nitric-Oxide Synthase，简称iNOS）表达的影响。方法：雄性SD大鼠随机分为对照组（CG）和运动疲劳组（EG），CG大鼠常规饲养不进行跑台运动，EG大鼠进行反复7天递增负荷的力竭跑台运动。采用免疫组化方法观察大鼠海马小胶质细胞形态和激活水平，通过半定量PCR技术检测海马组织IL-1β、TNF-α及iNOS mRNA的表达，并使用Y迷宫主动回避行为学检测学习和记忆能力。结果：与CG相比，EG大鼠海马小胶质细胞体积较大、胞体变圆、突起增多并且染色变深，统计学分析阳性细胞面积和染色消减灰度值均显著高于CG（P<0.05，P<0.01），IL-1β、TNF-α及iNOS mRNA的表达水平也显著性高于CG（P<0.01），并且EG大鼠学习记忆能力较CG大鼠显下降（P<0.05，P<0.01）。结论：反复力竭运动后，大鼠海马小胶质细胞处于激活状态，海马内炎症因子释放增多，并伴随有学习记忆能力的下降。提示：运动疲劳所致海马小胶质细胞的大量激活可能是引发神经炎症反应，进而降低大鼠学习记忆能力的重要因素之一。

小胶质细胞；运动疲劳；海马；炎症反应；学习记忆功能

运动应激所致的神经炎症反应是否在中枢疲劳的神经调控中发挥作用还鲜有报导。小胶质细胞（microglia，简称MG）是中枢神经系统中固有的免疫细胞，是神经炎症反应的重要参与者。正常情况下，MG处于静息状态，形态呈分枝状，胞体小且数量少；当机体受到应激刺激后，MG处于激活状态，形态呈“阿米巴样”，胞体变大、变圆，出现细胞增值、聚集等特征[1]，并显著上调多种促炎性细胞因子的分泌，在神经炎症反应中发挥重要作用[2]。海马是介导应激的重要脑区，也是参与学习记忆的主要核团。实验室前期研究发现，运动疲劳后海马CA1区突触长时程（long-termpotentiation，简称LTP）抑制以及神经元电活动的改变可能是导致大鼠学习记忆能力下降的重要原因[3-4]。近期的神经病理学研究表明，由海马MG激活介导的神经炎症反应是抑制LTP诱导，降低学习记忆功能的主要原因。由此推测，运动应激时可能也存在由海马免疫细胞活化介导的神经炎症反应，从而损害学习记忆功能。为此，本实验通过建立大鼠反复力竭运动模型，观察运动疲劳后海马区MG的形态学改变以及IL-1β、TNF-α和iNOS的表达变化，并同时检测大鼠学习记忆能力的改变，揭示海马区MG活化介导的免疫炎症反应是否参与了运动疲劳后学习记忆能力下降的神经生物学调控过程。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验选择清洁级健康雄性SD大鼠，体重（200±20）g，购自北京大学实验动物中心（许可证号：SCXK（京）2006-2008）。动物常规分笼饲养、自然光照、自由摄食和饮水，室温（20±3）℃，相对湿度40%～60%。适应性饲养2天后，将大鼠随机分为对照组（control group，简称CG）和运动组（exercise group，简称EG），每组18只。其中，有6只用于MG免疫组织化学染色，6只用于半定量PCR检测，另外6只用于Y迷宫主动回避实验。

1.2 运动疲劳模型的建立

本实验采用3级递增负荷跑台运动方案。动物先进行3天适应性跑台训练，从第4天开始正式跑台运动，负荷分为3级，每级跑速分别为8.2、15、20 m/min，第1、2级分别运动15 min，第3级运动直至大鼠无法维持跑台预定跑速，滞留于跑道后端3次以上，使用声波和光、电刺激驱赶仍无效，并伴有呼吸急促，腹卧跑台等行为表现[4]，运动周期为7天。对照组动物相同条件下常规饲养，不进行跑台运动。

1.3 Y迷宫主动回避实验

先将大鼠放在起步区无电刺激下适应3～5 min后通电电击，规定大鼠被电击后10 s从起步区直接逃至安全区为一次“正确反应”，若10 s后没有逃至安全区且仍在起步区为“主动回避错误”，10 s后逃离起步区但未到达安全区为“辨别错误”。每只大鼠被连续刺激20次，正确率90%作为学会标准（即连续20次电击中18次正确逃离），达标后立即停止训练。如未达到规定标准，l min后大鼠进行下一个20次训练，如此反复训练直到达标。记录其训练中出现的错误反应次数和训练时间作为大鼠学习能力的评定指标。学习测试结束24 h后，再用同样方法测试大鼠的记忆能力，观察并记录大鼠20次电击过程中的正确次数作为其记忆能力的评定指标。

1.4 小胶质细胞免疫组化染色

大鼠在运动力竭后即刻经水合氯醛麻醉，开胸经左心室灌流生理盐水200 mL冲洗血液，再用冰冷的4%多聚甲醛灌注5～ 10 min。灌流完毕后立即取脑，置于4%多聚甲醛后固定4 h，随后将脑转移到30%蔗糖溶液中直至沉底。切制50 μm厚的冠状冰冻切片，收集于0.1 mol/L磷酸缓冲液内，按下述步骤进行免疫组织化学染色。切片置于3%H2O2中室温封闭20 min；3%血清（中杉金桥生物技术有限公司）室温封闭30 min；一抗（鼠抗OX-42，1：500稀释，Serotec公司）室温孵育2 h；二抗（生物素标记的马抗小鼠IgG，1：500稀释，中杉金桥生物技术有限公司）室温孵育2 h，ABC复合物（1：200稀释，Vector公司）结合反应2 h；DAB显色剂显色20 min。然后将切片贴于涂有明胶的载玻片上，脱水透明，加拿大中性树脂封片。

1.5 半定量PCR

运动组大鼠在运动力竭后即刻断头取脑，抠取海马组织并提取总RNA，以oligo（dT）18为引物反转录为cDNA。根据基因库已知序列设计IL-1β、TNF-α、iNOS和β-actin基因设计引物，引物序列见表1。每个样本重复测定3次，用同一样品中β-actin的含量进行校正得到其相对值。

表1 半定量PCR目的基因和β-actin测试所用引物序列表Table1 The Primer sequence table of target gene and β-actin for semi-quantitative RT-PCR

1.6 图像采集及数据分析

光学显微镜下观察不同组别大鼠MG免疫组织化学脑片，采集图片并使用Image Pro Analysis Software（Media Cybernetics公司）软件进行MG阳性染色观察分析。将各样本PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用凝胶定量分析软件Quantity One version 4.3.1（Bio-Rad公司）进行图片处理，所得数据用平均数±标准误（Mean±SD）表示。应用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间差异比较采用独立样本T检验，P<0.05表示组间有显著性差异，P<0.01表示组间有极其显著性差异。

2 结果

2.1 小胶质细胞形态和表达变化

免疫组化结果显示，MG广泛分布于各组大鼠脑内，免疫染色呈棕黄色，位于胞质和突起中。安静状态下，海马区MG呈分枝状，胞体小并且数量少，处于非活化状态；而在EG大鼠海马内MG染色变深，体积较大、胞体变圆、突起增多的“阿米巴样”与SUGAMA等[1]的研究结果一致（见图1）。EG大鼠海马区免疫阳性小胶质细胞面积显著大于CG大鼠（P<0.05），并且EG大鼠阳性细胞染色消减灰度值也显著高于CG（P<0.01）（见图2）。

图1 海马区小胶质细胞的表达（n=6）Figure1 The expression of microglias cells in hippocampus（n=6）

图2 海马区MG阳性细胞面积和染色消减灰度值统计柱状图（n=6）Figure2 The statistical histogram of the area and the staining gray level of positive microglia cells in hippocampus（n=6）

2.2 炎症反应因子的表达变化

半定量PCR结果显示，运动疲劳后大鼠海马区IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表达水平较对照组均具有极其显著的统计学意义（P<0.01），3种炎症因子在EG大鼠海马区内分泌明显增多（见图3）。

图3 不同组别大鼠海马组织炎症因子mRNA的表达变化（n=6）Figure3 The change of expression of inflammation factor mRNA in hippocampus（n=6）

2.3 大鼠学习记忆能力的改变

Y迷宫主动回避测试运动疲劳对大鼠学习能力的影响，其中，反应学习能力的指标，即主动回避错误次数、辨别错误次数和训练时间统计结果均为EG大鼠显著高于CG（P<0.05，P< 0.01）。EG大鼠记忆能力，即记忆正确次数则显著低于CG（P< 0.01），可见运动疲劳后大鼠的学习和记忆能力均明显降低（见表2）。

表2 Y迷宫主动回避测试指标（Mean±SD，n=6）Table2 The testing index of Y maze active avoidance（Mean± SD，n=6）

3 讨论

电刺激、冷刺激[1-2]等急性刺激可激活脑内的MG已得到证实。在急性应激条件下，内分泌系统中下丘脑—垂体—肾上腺皮质（hypothalamic pituitary adrenal，简称HPA）轴的迅速激活，以及交感神经系统活动的增强，是脑内MG活化的重要通路[2]。与急性应激类似，运动应激也可快速激活HPA轴并增强交感神经系统的活动[5]，从而引起下丘脑内去甲肾上腺素（norepinephrine，简称NE）分泌的增加，NE可与MG膜上的β-肾上腺素能受体结合，通过第二信使环-磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP）将信号传入细胞核内，启动IL-1等多种炎症因子DNA转录，从而导致MG活化并合成释放大量炎症因子，如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18等。CARMICHAEL等[6]研究发现，运动疲劳引发神经炎性反应与外周炎症信号激活位于脑连接部位血管周围的巨噬细胞和脑内皮细胞产生的免疫应答有关。本研究结果也发现，运动疲劳时，脑内免疫细胞MG被大量激活。虽然目前还没有直接证据表明上调的炎症因子是否全部由激活状态的MG分泌，但大量神经病理学研究已证实[1-2，7]，MG激活是脑内炎症因子分泌增加的主要来源。由此推测，MG可能参与介导了运动疲劳引发的神经炎症反应过程。

IL-1β和TNF-α是应激时产生的主要促炎因子，其受体广泛分布于神经元和胶质细胞膜上。2种促炎因子与其受体（IL-1R、TNF-R）结合后，可激活丝裂原激活蛋白激酶类（mitogen-activated protein kinases，简称MAPKs）和核内NF-κB通路，启动IL-6、前列腺素E2、iNOS等炎症介质的基因转录，促进炎症反应发生[8-9]。目前，由MG激活引起的IL-1β、TNF-α分泌上调所致的脑高级功能的损害越来越受到学者们的关注。本研究发现，运动疲劳可显著增加炎症因子IL-1β、TNF-α以及炎症介质iNOS的分泌，并伴随学习记忆能力的下降。然而，运动疲劳大鼠海马脑区内IL-1β、TNF-α和iNOS的上调是否与学习记忆功能下降有关，尚缺乏直接的实验证据。根据现有的文献报道，大致可将致炎因子造成学习记忆功能下降的可能机制归为以下2个方面。（1）脑内上调的IL-1β、TNF-α可与其受体结合，启动胞内不同的信号通路，最终导致胞内钙超载，从而抑制LTP诱导。如TNF-α与TNF受体1（TNF-receptor 1，简称TNF-R1）结合后，上调α甲基恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor，简称AMPA）受体的表达，激活由第二信使三磷酸肌醇（inositol 1，4，5-triphosphate，简称IP3）介导的信号通路，引起钙离子大量内流[10]；IL-1β、TNF-α分别与膜受体IL-1R、TNF-R1和TNF-R2结合，激活Jun氨基末端激酶（jun N-terminal kinase，简称JNK）和p38促分裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，简称p38 MAPKs）的信号转导，造成突触后NMDA受体磷酸化，触发Ca2+大量内流，引起胞内钙超载[11-12]；TNF-α与TNF-R1的结合还可激活核内NF-κB通路，启动iNOS基因的转录，引起iNOS表达的增加，促进NO释放，造成细胞凋亡和胞内Ca2+浓度的升高[9，12]。（2）上调的IL-1β、TNF-α可抑制星形胶质细胞的谷氨酸（glutamate，简称Glu）转运功能，导致胞外Glu浓度升高，与膜上的G蛋白耦联代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptor，简称mGluR）结合，激活胞内第二信使IP3，引起胞内Ca2+的大量释放[12]，也是造成LTP抑制的因素。在本研究的基础上，今后将从胞内信号转导通路的角度继续深入研究神经炎症反应导致学习记忆功能下降的可能机制，为阐明二者之间的相互关系提供直接的实验依据。

4 小结

反复力竭运动后，大鼠海马小胶质细胞处于激活状态，海马内炎症因子IL-1β、TNF-α及iNOS释放增多，并伴随有学习记忆能力的下降。提示，海马脑区MG激活及其介导的神经炎症反应，可能通过多条信号转导通路参与了海马LTP的抑制过程，也是导致运动疲劳后大鼠学习记忆能力下降的重要因素之一。

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Exercise-induced Fatigue May Reduce Learning and Memory Function through Neuroinflammation Mediated byMicrogliaActivationinHippocampus

SUN Lina1，2，LIU Xiaoli2，QIAO Decai2
（1.School of PE，Taiyuan University of Technology，Taiyuan 030024，China；2.School of PE and Sport，Beijing Normal University，Beijing 100875，China）

Objective：To observe the effects of microglia morphology and expression of inflammation factors include interleukin 1 beta（IL-1β），tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）and inducer type Nitric-Oxide Syntheses（iNOS）in SD rat hippocampus after repeated exhaustive exercise.Methods：Male SD rats were randomly divided into control group（CG）and exercise-induced fatigue group（EG）.Seven days of increasing load exercise to build exercise-induced fatigue model，CG group was not intervention.The immunohistochemistry were used to observe the morphological and the activation level of microglia.The expression of IL-1β，TNF-α and iNOS mRNA in hippocampus was detected with semi-quantitative RT-PCR，and the Y maze active avoidance behavior were used to detect the learning and memory ability.Results：Compared with CG group，the volume of microglia cells was larger，the soma became round，the protuberance was increased and the stained was darker.Statistical analysis that the area of positive cells and the staining gray level were significantly higher than in control group（P<0.05，P<0.01），while the expression of IL-1β，TNF-α and iNOS mRNA was also significantly higher than the control group（P<0.01）. And the learning and memory ability of rats in exercise-induced fatigue group was significantly lower than the control group（P<0.05，P<0.01）.Conclusions：After repeated exhaustive exercise，the microglia cells were activated，inflammation factors in rat hippocampus were increased and the learning and memory ability of rat was declined.The results indicate that the microglia activation caused by exercise-induced fatigue may induce neuroinflammation and it might be one of the important factors leading to the decline of learning and memory ability in rats.

microglia；exercise-induced fatigue；hippocampus；inflammation；the function of learning and memory

G 804.2

A

1005-0000（2014）03-190-04

2013-12-10；

2014-03-05；录用日期：2014-03-06

国家自然科学基金项目（项目编号：31171138）

孙丽娜(1980-)，女，山西大同人，博士,讲师，研究方向为运动与神经调控；通信作者：乔德才（1957-），男，教授，博士，研究方向为运动与神经调控。

1.太原理工大学体育学院，山西太原 030024；2.北京师范大学体育与运动学院，北京 100875。