吡格列酮对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏氧化应激的影响

吴青红　阮水良

吡格列酮对非酒精性脂肪肝大鼠肝脏氧化应激的影响

吴青红阮水良

【摘要 】目的观察吡格列酮对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝脏组织氧化应激的影响。 方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组和吡格列酮组（每组10只）。正常组全程饲以普通饲料，另两组均给予高脂饮食。6周后每组各处死2只大鼠，验证NAFLD造模成功后，给予吡格列酮组大鼠10mg·kg-1·d-1吡格列酮灌胃，正常组、模型组给予相应体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。6周后处死并留取肝组织，行病理组织学检查，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）的含量，免疫组织化学法检测肝脏组织血红蛋白氧合酶（HO）-1的表达。 结果与模型组相比，吡格列酮组大鼠肝组织病变改善，MDA的含量显著下降，且该组肝脏组织内HO-1表达较正常组、模型组均显著升高（均P＜0.05）。 结论吡格列酮可诱导NAFLD大鼠肝脏组织内HO-1的表达，减弱氧化应激，可能是其改善NAFLD病理变化的机制之一。

【关键词 】吡格列酮非酒精性脂肪性肝病大鼠氧应激血红蛋白氧合酶

【 Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with high fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal group,model group and pioglitazone group(n=10 in each).NAFLS was induced by feeding of high-fat diet in rats of model and pioglitazone groups.Rats in pioglitazone group were gavaged with 10mg/kg of pioglitazone daily;rats in normal and model groups received an equal volume of saline.Two rats from each group were sacrificed at the end of week 6 for pathological examination;and at the end of week 12 all rats were sacrificed.The histological examinations were performed,contents of malondialdehyde(MDA)and heme oxygenase-1(HO-1)in liver were determined.ResultsCompared with model group,the degrees of hepatic steatosis and inflammation were significantly alleviated and contents of MDA in liver were decreased in pioglitazone group(P＜0.05).The liver HO-1 levels were significantly higher in pioglitazone group than those in normal and model groups(P＜0.05).ConclusionPioglitazone can induce the expression of HO-1 in liver,which is associated with its protective effect on oxidative stress and attenuation of non-alcoholic fatty liver disease in rats.

【 Key words】 PioglitazoneNon-alcoholic fatty liver diseaseRatsOxidative sressHeme oxygenase-1

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成为威胁人类健康的最常见慢性肝病之一[1]，它的发病机制尚不十分清楚，广为大家接受的是“二次打击”学说。虽然目前该学说受到一定的质疑，但氧应激在NAFLD疾病进展中的重要作用已得到很多学者的认可[2]。过氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）γ作为一种核转录因子，可在转录水平上调控包括抗氧化酶在内的多种基因的表达，近年来，有少量国内外研究表明其激动剂-吡格列酮可抑制氧化应激的增加，而关于吡格列酮对NAFLD氧化应激的影响尚未见报道。本实验以高脂饮食诱导大鼠NAFLD模型，用吡格列酮进行干预，观察其对该模型鼠的作用，并检测肝脏组织丙二醛（MDA）含量及血红蛋白氧合酶（HO）-1的表达，探讨吡格列酮对NAFLD的作用及其机制。

1　材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠30只，体质量200～220g，购自上海西普尔-必凯实验动物SCXK（沪）公司。饲养于上海市第六人民医院动物房，温度（20±2）℃，12h昼夜交替，按实验要求给予相应饲料喂养，各组动物自由进食和饮水。

1.1.2主要试剂、仪器盐酸吡格列酮片（商品名：艾可拓，日本武田药品工业株式会社），考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒（南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司），UNICO7200分光光度计（美国UNICO公司），RM2235石蜡切片机（德国Leica公司），兔抗鼠HO-1抗体（美国 Abcam公司），DAB显色试剂盒（基尔顿生物科技上海有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1NAFLD模型复制30只SD大鼠予普通饲料适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为正常组、模型组和吡格列酮组，每组10只。正常组继续饲以普通饲料，后两组均饲以高脂饲料（各营养成分供能比例为蛋白质18.0%，脂肪45.0%，碳水化合物 37.0%，保存于4℃冰箱）。6周后每组随机抽取2只大鼠处死，取肝脏组织行病理检查，观察NAFLD的造模情况。

1.2.2给药和取材各组大鼠除继续同前喂养外，吡格列酮组于每天固定时间给予吡格列酮10mg/kg体重（混悬液）灌胃，正常组和模型组分别给予相应体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。连续治疗6周，末次给药后，禁食12h，不禁水，氯胺酮麻醉（0.2ml/100g体重，腹腔注射）。处死后迅速取肝脏右叶的同一部位，切取数块大小约为1.5cm×1.5cm×0.3cm的肝脏组织，放入中性甲醛溶液中固定，其余肝脏组织放入冻存管中，储存于-80℃冰箱备用。

1.3观察指标及方法

1.3.1肉眼观察各组大鼠肝脏的色泽、质地等。

1.3.2组织病理学观察取固定后的肝脏组织，常规石蜡包埋，连续切片，HE染色。显微镜下观察肝脏组织学改变情况。

1.3.3肝脏组织MDA含量的测定用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，硫代巴比妥酸法测定MDA的含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行，测试结果以“nmol/ mgprot”表示。

1.3.4肝脏组织内HO-1的表达行免疫组织化学染色法检查肝脏组织细胞内HO-1的表达及分布情况。将肝脏组织石蜡切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，经抗原修复、正常血清封闭后，滴加HO-1多克隆兔抗鼠一抗后4℃过夜，次日滴加二抗，DAB显色，经苏木素复染后封片，阴性对照，用PBS替代一抗。光镜下随机选取每张切片3个不重复视野，测定阳性区域面积及光密度（OD）值。取平均OD值代表阳性表达的强弱。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。

2　结果

2.1肝脏大体观正常组大鼠肝脏颜色深红，表面光滑，边缘锐利，质地较软；模型组肝脏较正常组体积增大、色偏黄、表面有颗粒感，边缘变钝、质脆、切面带油腻，吡格列酮组大鼠肝脏色泽、质地、体积均较模型组改善，与正常组接近。

2.2肝脏组织病理学观察光镜下见正常组大鼠肝脏小叶结构完整清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝细胞形态大小如常，无明显脂肪变性、炎症细胞浸润；模型组大鼠肝细胞小叶结构排列紊乱，多数肝细胞内可见大小不等，数量不一的脂肪空泡，肝细胞出现气球样变，并伴有不同程度的肝细胞碎屑样坏死和炎症细胞浸润，少数存在桥接坏死，部分出现汇管区炎症；吡格列酮组肝细胞脂肪变、炎症程度均较模型组改善，详见图1。

2.3各组大鼠肝脏组织内MDA的含量模型组肝组织内MDA的含量为（1.02±0.15）mmol/mgprot，较正常组的（0.49±0.08）nmol/mgprot显著增加（P＜0.05）；吡格列酮组为（0.55±0.11）nmol/mgprot，较模型组显著下降（P＜0.05），且与正常组的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1　各组大鼠肝脏组织病理学检查所见（A：正常组；B：模型组C：吡格列酮组；HE染色，×200）

2.4肝脏组织HO-1表达的变化HO-1免疫组织化学染色显示，正常组大鼠肝脏无明显阳性染色，模型组大鼠肝实质细胞及肝脏组织浸润的炎性细胞内可见到弱阳性表达，吡格列酮组大鼠肝脏组织的上述部位呈棕褐色颗粒物强阳性表达，其中胞质的染色较深，阳性染色OD值为0.31±0.04，较正常组的0.12±0.02、模型组的0.15±0.01均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3　讨论

目前，噻唑烷二酮类药物已广泛用于治疗代谢紊乱的相关性疾病，尤其是2型糖尿病的治疗，其主要机制为通过作用于PPARγ而调节脂质代谢、改善胰岛素抵抗。PPARγ作为一种核转录因子，可与其特异性配体结合、激活，进而在转录水平上调控多种基因的表达。近年来国内外少数研究表明PPARγ可通过调节抗氧化、抗炎症基因的表达，表现出非降糖降脂作用的独立机体保护功效。如Wang等[3]研究发现活化PPARγ具有减弱急性肺损伤及呼吸窘迫综合征过程中的炎症反应及氧应激的作用，且该功效部分程度上与其诱导抗氧化酶HO-1，进而调节高迁移率组蛋白的表达相关。近年来，PPARγ激动剂-吡格列酮较强的抗氧化活性得到越来越多学者的关注。有研究发现，吡格列酮可降低炎症反应从而减弱铁所导致的黑质纹状体多巴胺系统氧化应激，还可改善血管紧张素-Ⅱ造成的高血压大鼠心脏收缩舒张功能紊乱，减少肾脏脂质含量及蛋白尿[4-5]，且该作用与其维持HO-1的表达，进而减弱氧应激密切相关[6]。由此可见，吡格列酮可诱导和/或维持抗氧化酶HO-1的高表达，减弱氧化应激及其相关的机体损伤。

HO-1是HO家族中的一种亚型，是血红蛋白代谢的起始酶和限速酶。作为一种抗氧化酶，HO-1广泛参与抗炎、抗氧化应激损伤，是机体内重要的内源性保护机制。NAFLD的发生、发展与氧化应激密切相关，最近的研究发现NAFLD患者体内HO-1的表达增加，我们的实验结果亦显示模型组大鼠肝脏组织内HO-1表达较正常组升高，因此，正如Wang等[7]的推测，HO-1可能是机体应对氧化应激等损伤时的一种应激性防护反应。Inoue等[8]在研究蛋氨酸-胆碱缺乏饮食诱导非酒精性脂肪性肝炎（NASH）时发现，敲除Bach1基因（HO-1的转录抑制基因）组大鼠表现出HO-1高表达，同时在病理组织学上，炎症、纤维化程度及肝脏组织内氧应激指标MDA的水平均低于对照组。因此，我们推测，诱导及维持体内HO-1高表达将有利于延缓NAFLD的进展。目前，大量临床前及临床试验均表明PPARγ激动剂-吡格列酮可改善NAFLD患者的生物代谢指标和肝脏组织病理[9-10]，由此可知，吡格列酮可诱导及维持HO-1的高表达，但关于吡格列酮在NAFLD模型鼠中的抗氧化作用及其对HO-1的影响尚未见报道。本实验以高脂饮食诱导NAFLD模型，并给予吡格列酮干预，观察所见与众多研究结果一致，该药物可减轻高脂饮食所致的肝脏组织脂肪及炎症病变，此外，吡格列酮干预组大鼠肝脏组织内抗氧化酶HO-1的表达显著升高，进一步证实了PPARγ激动剂可上调PPARs靶基因HO-1的表达。同时，吡格列酮组大鼠肝脏组织内氧应激指标MDA的含量显著降低，表明该药物降低了NAFLD大鼠肝脏组织内的氧化应激。

基于NAFLD的发病机制及近年来关于吡格列酮抗氧化作用的研究基础，本实验自造模成功始给予吡格列酮干预治疗，以研究其抗氧化作用及对HO-1表达的影响。实验结果证实吡格列酮可增加抗氧化酶HO-1的表达，降低氧化应激，这可能是其改善NAFLD模型鼠肝脏组织病理的另一作用机制，但这一机制尚需更加深入的研究。

4　参考文献

[1]Vernon G,Baranova A,YounossiZ M.Systematic review:the epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in adults[J].Aliment Pharmacol Ther,2011,34(3):274-285.

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（本文编辑：沈叔洪）

收稿日期：（2013-11-18）

作者单位：323800庆元县中医院消化内科（吴青红）；嘉兴市第二医院消化内科（阮水良）

通信作者：阮水良，E-mail：ruanguan@aliyun.com

Effects of pioglitazone on oxidative stress in rats with non-alcoholic fatty liver disease

WU Qinghong，RUAN Shuiliang.Department of Gastroenterology,Qingyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lishui 323800,China