磷酸二酯酶4D基因与脑梗死患者颈动脉粥样硬化的关系

郑海滨　胡兴越　李卫玲　周元林　朱通伟

磷酸二酯酶4D基因与脑梗死患者颈动脉粥样硬化的关系

郑海滨胡兴越李卫玲周元林朱通伟

【摘要】目的探讨脑梗死患者磷酸二酯酶4D（PDE4D）基因SNP83的单核苷酸多态性与脑梗死患者颈动脉粥样硬化的关系。 方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法分析350例脑梗死患者PDE4D基因SNP83的单核苷酸多态性。超声检查评估颈动脉斑块和颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）内中膜厚度。 结果279例患者存在颈动脉斑块，易损斑块组CC+CT基因型频率为47.1%，稳定斑块组为30.4%，两组比较差异有统计学意义[P=0.007，OR=2.034，95%CI（1.204～3.436）]；易损斑块组C等位基因频率为25.3%，稳定斑块组则为16.8%，两者比较差异有统计学意义[P=0.019，OR=1.682，95%CI（1.087～2.603）]。TT基因型和CC+TT基因型CCA的IMT分别为（1.06±0.08）mm和（1.13±0.08）mm，两者差异具有统计学意义（t=8.444，P＜0.05）。 结论PDE4D基因SNP83位点单核苷酸多态性可能与浙江地区汉族脑梗死患者的颈动脉粥样硬化相关，C等位基因可能是颈动脉斑块易损和CCA IMT增厚的遗传易患性标志之一。

【关键词】磷酸二酯酶4D脑梗死单核苷酸多态性颈动脉疾病

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between the single nucleotide polymorphism of SNP83 in phosphodiesterase 4D(PDE4D)gene and carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction.MethodsThree hundred and fifty patients with cerebral infarction admitted in Department of Neurology,Taizhou Hospital were enrolled in the study.The polymorphism of SNP83 in PDE4D gene was detected with polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).The carotid plaque and intima-media thickness(IMT)of common carotid artery(CCA)and internal carotid artery (ICA)were evaluated by ultrasonography.ResultsCarotid plaques were detected in 279 acute infarction patients,including 85 cases with carotid vulnerable plaques and 194 cases with carotid stable plaques.The frequency of CC+CT genotypes in vulnerable plaque group was significantly higher than that in stable plaque group（47.1%vs 30.4%,P=0.007,OR=2.034,95%CI: 1.204～3.436）,and the frequencies of C allele were 25.3%and 16.8%in the two groups,respectively（P=0.019,OR=1.682,95% CI:1.087～2.603）.The IMT of CCA in patients with TT and CC+TT genotypes was 1.06±0.08mm and 1.13±0.08mm,respectively（t=8.444,P＜0.05）.ConclusionThe single nucleotide polymorphism of SNP83 in PDE4D gene is associated with carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction and C allele may be a predictor for the susceptibility of carotid vulnerable plaque and the increased IMT of CCA.

【 Key words】 Phosphodiesterase 4DCerebral infarctionSingle nucleotide polymorphismCarotid artery disease

脑卒中是全球性的公共卫生问题，是世界性的致死、致残的主要原因，也是目前人类疾病三大死亡原因之一。我国是脑卒中的高发国家，其中脑梗死约占70%，其最常见的病因是动脉粥样硬化。冰岛的de－CODE遗传学研究组在2003年从单核苷酸多态性角度最早报道了磷酸二酯酶4D（phosphodiesterase，PDE4D）基因与脑卒中的相关性，发现PDE4D基因多个位点与颈动脉源性脑梗死有关[1]。后续针对PDE4D基因与脑梗死的相关性研究较多，但少见涉及发病机制的相关报道。本研究拟探讨PDE4D基因的SNP83单核苷酸多态性与浙江省汉族人群脑梗死患者颈动脉粥样硬化的关系，以阐明其与脑梗死相关联的可能机制。

1　对象和方法

1.1对象选择2010-02—10在浙江省台州医院神经内科首次因脑梗死住院的患者350例，经颈动脉超声检查证实存在颈动脉粥样硬化斑块279例。根据Mathiedsen等[4]制定的标准，将颈动脉斑块呈高回声的患者纳入稳定斑块组，呈混合回声、低回声的患者纳入易损斑块组。稳定斑块组共194例，其中男106例，女88例，年龄38～86（65.66±9.57）岁；易损斑块组85例，男45例，女40例，年龄36～87（65.12±10.91）岁。入院时发病时间均≤72h，诊断均符合1995年全国第四届脑血管病学术会议制定的标准[2]，排除无症状性脑梗死、梗死后出血和脑出血。所有研究对象均为浙江地区无血缘关系的汉族人。既往均无脑卒中史，排除感染性疾病、甲状腺疾病、风湿性疾病、血液系统疾病、急性心肌梗死、心房颤动、严重冠状动脉狭窄、腹主动脉瘤、严重肝肾功能不全、结核、妊娠、哺乳期妇女及1个月内有手术、外伤史的患者。

1.2主要试剂饱和酚为AMRESCO产品，2×Master－Mix购自北京天根生化科技有限公司，限制性内切酶Tai I及其缓冲液为New England Biolabs公司产品，PCR产物纯化试剂盒购自上海捷瑞公司，引物由上海基康公司合成。

1.3方法

1.3.1吸烟史及饮酒史的判定≥10支/d且烟龄≥1年者判定为有吸烟史，戒烟10年以上判为无吸烟史；饮酒≥1年且男性酒精摄入量＞40g/d或女性酒精摄入量＞20g/d判定为有饮酒史。

1.3.2颈动脉超声评估由指定超声科高年资医师专人操作。舒张末期测量颈总动脉分叉处近端1cm、颈总动脉分叉处以及颈内动脉起始段1 cm后壁的内中膜厚度（intima-media thickness，IMT），双侧各测量3次，取其平均值，记录颈总动脉（CCA）的IMT和颈内动脉（ICA）的IMT数值。

1.3.3标本采集抽取入组者入院第2天的清晨空腹静脉血2ml，以EDTA-Na2抗凝，用于基因组DNA抽提，保存于-86℃冰箱中冻存备用。

1.3.4单核苷酸多态性分析采用PCR限制片段长度多态性检测方法。（1）DNA的抽提：采用低渗溶血-酚/氯仿法从白细胞中抽提基因组DNA，适量灭菌双蒸水溶解，核酸定量分析仪测定DNA浓度和A260/A280比值，将比值位于1.7～2.0者作为PCR扩增模板。（2）PCR扩增SNP83位点，上游引物为5′-GATTTATGTCTTA TACTTTC-3′，下游引物为5′-TGCTTTTTGAAGATGCATACTTTGT-3′。PCR反应体系为上下游引物0.5μl+ 0.5μl（各 20μmol/L），2×MasterMix12.5μl，DNA模板0.1μg，加双蒸水至总体积25μl。PCR反应条件：预变性95℃，2min；变性94℃，45s；退火58℃，45s；延伸72℃，1min，共35个循环，吸取扩增产物6μl，于1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像分析PCR产物特异性。（3）酶切反应：取经纯化后的PCR产物进行酶切，反应体系包括PCR产物1μg，10×缓冲液2μl，限制性内切酶Tai I 10U，加双蒸水至总体积20μl，置37℃水浴酶切16h后，终止酶切反应，产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后，EB染色，凝胶成像系统判定结果。

1.4统计学处理采用PASW Statistics 18统计软件。用基因计数法计算两组基因型和等位基因频率，等位基因频率=（2×纯合子数+杂合子数）（/2×受检人群），频率比较采用χ2检验，以比值比（OR）及其95%CI表示相对风险度；计量资料以表示，采用独立样本t检验。采用非条件性logistic回归筛选危险因素。

2　结果

2.1稳定斑块与易损斑块组临床资料的比较见表1。

表1　稳定斑块与易损斑块组临床资料的比较

由表1可见，稳定、易损斑块患者间的性别、年龄、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、血压、体重指数、空腹血糖、血脂、纤维蛋白原水平等指标的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2危险因素分析见表2。

由表2可见，最终进入模型的危险因素有甘油三酯、LDL-C、CC+CT基因型，说明PDE4D基因SNP83位点突变是脑梗死患者颈动脉斑块易损性的危险因素之一。

2.3PDE4D基因SNP83位点PCR-RFLP检测见图1。稳定斑块组和易损斑块组的SNP83基因型分布见表3。

由图1可见，PDE4D基因SNP83位点PCR扩增产物大小为368bp，经限制性内切酶Tai I酶切后，纯合子CC基因型为152bp、216bp两个片段，纯合子TT基因型无酶切位点，为1个368bp片段，杂合子CT基因型酶切后可见152bp、216bp、368bp共3个片段。

表2　非条件Logistic回归分析危险因素

图1　SNP83位点PCR扩增产物经内切酶TailⅠ酶切后行2.5%琼脂糖凝胶电泳图[泳道1为100bp DNA marker，泳道2～3为CT基因型（152bp、216bp、368bp），泳道4～6为TT基因型（368bp），泳道7为CC基因型（152bp、216bp）]

表3　稳定斑块与易损斑块组间SNP83位点基因型和等位基因频率比较[例（%）]

由表3可见，经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究对象来自同一个总体，具有群体代表性（χ2=0.112和1.849，P=0.738和0.174）。易损斑块组CC+CT基因型频率与稳定斑块组比较差异有统计学意义，易损斑块组C等位基因频率分布与稳定斑块组比较差异有统计学意义。

2.4PDE4D基因SNP83位点不同基因型患者之间CCA和ICA的IMT比较见表4。

表4　PDE4D基因SNP83位点不同基因型患者之间的CCA和ICA的IMT比较（mm）

由表4可见，TT基因型和CC+TT基因型CCA的IMT差异有统计学意义（t=8.444，P＜0.05），而ICA的IMT差异无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨论

PDE是一个多基因大家族，PDE4D是PDE超家族的成员之一。PDE4D基因位于5q12，其长度大约1.5Mb，至少有22个外显子，编码至少9个不同的异构体[3]。已有较多研究提示PDE4D基因与缺血性卒中可能存在较为密切的关联。如Staton等[4]在对澳大利亚人群的一份病例对照研究发现，PDE4D基因与脑梗死有强相关性，其中SNP89、SNP87、SNP83均为代表性的位点。进一步研究发现，PDE4D基因不同位点基因多态性与脑梗死的关联可能受人种、地域等相关因素影响。SNP83位点的基因多态性与亚洲人脑梗死的关系在多项研究中已得到证实，如印度的Munshi等[5]的研究就提示SNP 83基因多态性和大动脉粥样硬化性卒中及小动脉闭塞型卒中这2个亚型相关，并和常见的危险因素如糖尿病、吸烟等相关。进一步针对中国汉族人群的相关研究也得到类似结果，Li等[6]发现SNP83基因多态（T/ C）和汉族人脑梗死有关联，而近期王汉旻等[7]针对中国汉族人群PDE4D基因与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中的相关研究也表明，PDE4D基因SNP83是动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中的危险基因。

动脉粥样硬化是脑梗死和冠状动脉粥样硬化性心脏病等各种血管事件的主要危险因素，颈动脉粥样硬化更是与脑梗死具有密切关联[8]。易损斑块不可预测地破裂、血小板激活和血栓形成是动脉粥样硬化性脑梗死重要的发病机制之一[9]。Liao等[10]发现PDE4D基因的rs702553多态性与颈动脉的斑块形成密切相关，TT等位基因型的斑块危险性更大。本研究发现在浙江汉族人群中，易损斑块组PDE4D基因SNP83的CC+CT基因型比例明显高于稳定斑块组，且C等位基因频率也高于稳定斑块组。一般认为，IMT增厚是颈动脉粥样硬化的表现，Hedera等[11]研究发现脑梗死患者的IMT明显高于健康人群。我们通过对PDE4D基因SNP83位点不同基因型间的CCA IMT和ICA IMT的比较，发现CC+CT基因型CCA的IMT显著增高。均提示PDE4D基因SNP83位点与脑梗死患者的颈动脉粥样硬化具有密切关联。

在动脉粥样硬化过程中，血管平滑肌细胞的迁移、增殖，并与炎性病变内的炎性成分形成混合物，导致动脉壁增厚，并进一步参与了覆盖在脂质核心和坏死组织上的纤维帽的形成过程，血管平滑肌细胞还与细胞外基质的合成与分泌有关，相关异常可以造成使纤维帽强度减弱，斑块变得易损[12]。PDE4D基因的蛋白产物PDE4D可以通过水解细胞内的第二信使（cAMP，环磷酸腺苷）来促进平滑肌细胞的增殖和迁移加速[13]，这是颈动脉粥样硬化过程中的关键事件，也已被动物实验模型所证实[14]。我们推测PDE4D基因SNP83的C等位基因可能通过调控PDE4D基因的表达而影响血管平滑肌细胞的增殖、迁移和细胞外基质的分泌等相关过程，从而使CCA的IMT增厚，影响颈动脉斑块的稳定性。

本研究表明，PDE4D基因SNP83位点的CC+CT基因型可能与浙江汉族脑梗死患者的颈动脉粥样硬化相关，C等位基因可能影响颈动脉斑块的稳定性和CCA IMT的增厚，可能是两者的遗传易患基因。PDE4D基因SNP83的单核苷酸多态性有望于应用于脑梗死患者颈动脉粥样硬化的早期评估和治疗。

4　参考文献

[1]Gretarsdottir S,Thorleifsson S,Reynisdottir S T,et al.The gene encoding phosphodiesterase 4D confers risk of ischemic stroke[J]. Nat Genet,2003,35(2):131-138.

[2]中华神经科学会中华神经外科学会.各类脑血管病诊断要点 [J].中华神经科杂志,1996,29(6):379-380.

[3]Le Jeune I R,Shepherd M,Van Heeke G,et al.Cyclic AMP-dependent transcriptional up-regulation of phosphodiesterase 4D5 in human airway smooth muscle cells.Identification and characterization of a novel PDE4D5 promoter[J].J Biol Chem,2002,277 (39):35980-35989.

[4]Staton J M,Sayer MS,Hankey G J,et al.Association between phosphodiesterase 4Dgene and ischaemic stroke[J].J NeurolNeurosurg Psychiatry,2006,77(9):1067-1069.

[5]MunshiA,Babu MS,KaulS,et al.Phosphodiesterase 4D(PDE4D) gene variants and the risk of ischemic stroke in a South Indian population[J].J NeurolSci,2009,285(1-2):142-145.

[6]Li N,He Z,Xu J,et al.Association of PDE4D and IL-1 gene polymorphism with ischemic stroke in a Han Chinese population[J]. Brain Res Bull,2010,81(1):38-42.

[7]王汉旻,陈晓丽,叶好好,等.磷酸二酯酶4D基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中的关系[J].医学研究杂志，2012,41(4):134-138.

[8]陶红苗,邵蓓.脑梗死患者颈动脉粥样硬化和高尿素的关系[J].浙江医学, 2008,30(3):257-259.

[9]Hollander M,Bots M L,Del Sol A I,et al.Carotid plaques increase the risk of stroke and subtypes of cerebral infarction in asymptomatic elderly:the Rotterdam study[J].Circulation,2002,105(24): 2872-2877.

[10]Liao YC,Lin H F,Guo YC,et al.Sex-differentialgenetic effect of phosphodiesterase 4D(PDE4D)on carotid atherosclerosis[J]. BMC Med Genet,2010,11:93.

[11]Hedera P,Bu jdakova J,Traubner P,et al.Stroker isk factor and developmentofcollateral flowincarotid occlusive disease[J].Acta Neurolscand,1998,98(3):182-186.

[12]Rudijanto A.The role of vascular smoth muscle cells on the pathogensis ofatherosclerosis［J］.Acta Med Indones,2007,39(2): 86-93．

[13]Housplay M D,Adams D R.PDE4D cAMP phosphodiesterase: modular enzymes that orchestrate signaling cross-talk,desensitization and compartmentalization[J]．Biochem J,2003,370(pt1): 1-18．

[14]Liu L,Xu X,Li J,et al.Lentiviral-Mediated shRNA Silencing of PDE4D Gene Inhibits Platelet-Derived Growth Factor-Induced Proliferation and Migration of Rat Aortic Smooth Muscle Cells[J]. Stroke Res Treat,2011,2011,article 534257.

（本文编辑：杨丽）

更正启事

本刊2014年第7期第602页表1“例7”下方增补一行：

例858男颈总动脉双侧右侧85%左侧50%脑梗死鼻咽癌6

特此更正。

本刊编辑部

收稿日期：（2013-03-25）

作者单位：317000浙江省台州医院神经内科（郑海滨、李卫玲、周元林、朱通伟），浙江大学医学院附属邵逸夫医院神经内科（胡兴越）

通信作者：胡兴越，E-mail：Huxingyue2003@126.com

Association between phosphodiesterase 4D gene polymorphism and carotid atherosclerosis in patients with cerebral infarction

ZHENG Haibin，HU Xingyue，LI Weiling，et al.Department of Neurology，Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000,China