新城疫病毒NP蛋白MHC I类分子限制性T细胞表位研究

乔长涛，谭 磊，于圣青，仇旭升，宋翠萍，孙英杰，胡桂学，丁 铲

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

新城疫病毒NP蛋白MHC I类分子限制性T细胞表位研究

乔长涛1,2，谭 磊2，于圣青2，仇旭升2，宋翠萍2，孙英杰2，胡桂学1，丁 铲2

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

为了对新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）表位进行研究，本研究通过在线分析软件预测了NDV弱毒株La Sota和强毒株Herts/33 NP蛋白的MHC I类分子限制性表位，共获得9条可能的表位多肽序列，并人工合成了这些短肽。分别构建了含有La Sota和Herts/33 NP基因的DNA重组质粒并免疫4周龄SPF级C57BL/6小鼠，首免后21 d加强免疫1次，二免后10 d无菌采集脾脏制备脾淋巴细胞悬液，采用ELISpot法测定预测多肽诱导脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力，根据分泌IFN-γ形成的特异性斑点数进行生物统计学分析，发现2条多肽产生的斑点数显著高于无关肽刺激组（P＜0.01）。确定了针对小鼠H-2 kb的限制性T细胞抗原表位的2条多肽。这些可用于合成特异性的MHC-肽四聚体，为后续研究NDV与树突状细胞（dendritic cells，DC）及T淋巴细胞之间的免疫抑制机制提供重要保障。

新城疫病毒；NP蛋白；CTL表位；筛选

新城疫（Newcastle disease, ND）是由副粘病毒科（Paramyxoviridae）、副粘病毒亚科（Paramyxovirinae）禽副粘病毒Ⅰ型引起禽类的一种烈性传染病，该病被国际兽医局（OIE）列为必须上报的A类疫病之一[1]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）基因组为不分节段、单股负链RNA，病毒粒子的外部是来自宿主细胞膜的双层脂质囊膜，内部为螺旋对称的核衣壳[2]，其中核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）是NDV核衣壳的主要结构蛋白，其N端高度保守，与病毒基因组RNA直接结合构成NPRNA复合体，作为复制和转录的模板，具有高度的免疫原性，能够较好地介导细胞免疫应答[3,4]。

能够被T细胞受体（T cell receptor，TCR）识别的抗原表位称为T细胞表位[5]。T细胞表位包括细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）表位和辅助性T细胞（helper T cell，Th）表位两类，CTL表位多为8～10个氨基酸的多肽，主要结合MHC I类分子，Th表位多为12～25个氨基酸的多肽，主要与MHC II类分子结合[6]。表位成分是蛋白质降解后的多肽，其类型多为线性表位。T细胞表位主要与抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）中的MHC分子结合后提呈到细胞表面，被TCR识别后激活T细胞免疫应答[7]。目前，利用在线表位预测服务器BepiPred Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/）、SYFPEITHI数据库（http://www.syfpeithi.de/）Epitope Predictor（http://atom.research.microsoft.com/bio/epipred.aspx）等对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）和小鼠主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC，又称H2）在基因座位上预测抗原表位的成功率相对较高，但是任何预测得到的表位多肽都需要进行体外和体内试验加以验证后才能确定为功能性表位。

本研究利用C57BL/6小鼠作为哺乳动物模型，对NDV NP蛋白的MHC I类分子限制性表位进行了预测，并通过动物实验进行了表位筛选，旨在为后续使用MHC-肽四聚体检测特异性CD8+T细胞增殖实验奠定基础，同时为阐明NDV与DC及T淋巴细胞之间的免疫抑制机制提供重要保障。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及细胞系 本实验所用La Sota毒株、Herts/33毒株，子宫颈癌细胞系（Hela）、人肾上皮细胞系（293T）均由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和实验动物 pVAX1载体由本实验室保存；小鼠抗NDV NP蛋白单克隆抗体由本实验室制备；脂质体转染试剂FuGENE、T4 连接酶、pGEM-T easy载体购自Promega 公司；限制性内切酶购自TaKaRa大连宝生物公司；质粒提取试剂盒购自QIAGEN公司；胰蛋白胨、酵母购自OXOID公司；Noble琼脂购自Difco公司；Trizol购自Invitrogen公司；DMEM细胞培养基、RPMI-1640细胞培养基、Opti-MEM细胞培养基、胎牛血清购自Gibco公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠IgG购自Jackson公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）、刀豆球蛋白A（Con A）购自Sigma公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Cy3标记山羊抗小鼠IgG、Western细胞裂解液购自碧云天生物技术公司；小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋公司；小鼠IFN-γ ELISpot检测试剂盒购自eBioscience公司；ELISpot 96孔板购自Millipore公司；SPF小鼠购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物有限公司；多肽委托上海吉尔生化公司合成；引物合成和DNA测序委托上海生工有限公司完成；ELISpot数据读取委托北京莱比信科技发展有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 多肽的设计 利用在线表位预测数据库SYFPEITHI、Epitope Predictor对La Sota和Herts/33毒株NP蛋白的氨基酸序列进行比对分析，根据C57BL/6小鼠MHC I类分子限制性表位结合特点，预测了9条可能的CTL表位多肽序列（见表1）。

1.2.2 La Sota和Herts/33 NP基因真核表达质粒的构建将La Sota 病毒尿囊液以1:1000倍稀释、Herts/33病毒尿囊液以1:100 000倍稀释后分别接种9～11日龄SPF鸡胚，Herts/33病毒的扩增要收集24 h以后死亡鸡胚的尿囊液，而La Sota病毒接种SPF鸡胚72 h后置于4 ℃过夜再收集尿囊液。以Trizol法对病毒尿囊液进行RNA提取，然后用随机引物反转录合成cDNA。根据GenBank发表的La Sota毒株（JF950510.1）、Herts/33毒株（AY741404.1）NP基因核苷酸序列分别设计引物（见表2）。

表1 针对NDV NP小鼠MHC I类分子限制性表位预测结果Table 1 Predicting results of the mouse MHC I restricted epitopes against NDV NP protein

表2 扩增La Sota、Herts/33 NP基因引物Table 2 Primers for amplif cation La Sota, Herts/33 NP genes

PCR反应程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸 90 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，将回收片段连入pGEM-T easy载体，4 ℃连接过夜，转化DH5α，挑取单个菌落扩增后进行质粒提取，双酶切鉴定有目的片段的送公司测序。测序正确的质粒双酶切回收目的片段后与相应双酶切回收的pVAX1载体连接，转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落扩增后进行质粒提取，双酶切鉴定阳性的质粒进行测序验证。阳性重组质粒命名为La-NP-pV、H33-NP-pV。

1.2.3 间接免疫荧光（indirect immnnofluotesent method，IFA）检测重组质粒NP蛋白的表达 取35 mm Dish，放入细胞爬片并接种Hela细胞。当细胞生长至50%～70%时，按照FuGENE转染试剂说明书分别转染La-NP-pV和H33-NP-pV，然后置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养48 h。48 h后以4%多聚甲醛固定细胞，0.5% Triton X-100透化细胞，然后加入山羊血清在37 ℃湿盒中封闭30 min，37 ℃湿盒孵育小鼠抗NP蛋白抗体2 h（一抗稀释度为1:1000），PBST洗涤5次，每次5 min，避光加入Cy3标记山羊抗小鼠IgG二抗，在37 ℃湿盒中避光孵育1 h，PBST洗涤5次，每次5 min，避光加入DAPI，室温作用10 min，PBST洗涤5次，每次5 min，用甘油封片剂封片，于荧光显微镜下观察。

1.2.4 Western-blot检测重组质粒NP蛋白的表达 将生长状态良好的293T细胞接种35 mm Dish，当细胞密度生长到70%～80%时，按照FuGENE转染试剂说明书转染重组质粒，然后置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养48 h后收集细胞沉淀，用Western细胞裂解液裂解细胞，再短暂超声2～3次，离心吸取裂解上清液，向其加入上样缓冲液后沸水中煮沸10 min，制备好的样品可置于－20 ℃保存备用。SDS-PAGE电泳，电泳后将凝胶取出，250 mA恒流湿转100 min。转印后的PVDF膜用5%脱脂乳室温封闭1 h，加入小鼠抗NP蛋白抗体（一抗稀释度为1:1000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入HRP标记山羊抗小鼠二抗，室温孵育1 h后用TBST漂洗3次，每次5 min，以ECL底物显色试剂盒显色，在X感光片下曝光。

1.2.5 小鼠免疫 将构建好的重组质粒La-NP-pV、H33-NP-pV转化DH5α感受态细胞，挑取单个菌落扩增后进行质粒提取，经核酸定量测定浓度后，按每只150 μg质粒免疫4周龄SPF级C57BL/6小鼠，3周后加强免疫1次，二免后10 d无菌分离脾淋巴细胞进行表位筛选。免疫分组（见表3）。

表3 实验分组及免疫程序Table 3 Grouping and immunization procedure of mice

1.2.6 ELISpot检测免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌 将加强免疫10 d后的小鼠断颈处死，无菌操作取出脾脏，以机械匀浆的方法制备脾脏单细胞悬液。将制备好的脾脏单细胞悬液小心加于2 mL淋巴细胞分离液的液面上，以400×g（水平转子）离心15 min，吸取环状乳白色淋巴细胞放入含有5 mL RPMI-1640完全培养基（10%胎牛血清、1%双抗）的离心管中，充分混匀后，以500×g离心20 min后弃去上清，重复洗涤2次即得所需细胞。RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀并进行细胞计数，将细胞密度稀释到5×106个/mL待用。根据小鼠IFN-γ ELISpot检测试剂盒操作说明，将捕获抗体用包被稀释液稀释后加入ELISpot板中，100 μL/孔，4 ℃包被过夜。弃去包被抗体并用包被稀释液洗涤2次，200 μL/孔，然后每孔加入200 μL RPMI-1640完全培养基室温封闭1 h。将稀释好的脾淋巴细胞加入ELISpot板中，100 μL/孔（细胞数量为5×105个/孔），按照预先免疫分组，将9条多肽刺激物分别加入各孔，剂量为100 μg/孔，并设立复孔及阳性、阴性、空白对照。阳性对照加入阳性刺激物Con A（2μg/mL），阴性对照加入NC肽（100μg/孔），空白对照为不加多肽的脾淋巴细胞，同时设立背景负对照（不含细胞的培养基）。将ELISpot板置于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱内培养48 h后倾倒孔内细胞及培养基并用PBST洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体，100 μL/孔，室温作用2 h后弃去检测抗体并以PBST洗涤4次，每次洗涤浸泡1 min，再加入HRP标记的抗生物素蛋白，100 μL/孔，室温作用45 min后用PBST洗涤3次，再用PBS洗涤2次，然后加入新配置的AEC底物显色液，100 μL/孔，室温反应10～60 min，监测斑点的变化情况，最后用蒸馏水洗涤3次以终止反应，200 μL/孔。

1.2.7 数据分析 ELISpot试验独立重复3次并采用SPSS 13.0 软件对斑点进行t检验、单因素方差分析，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 构建La Sota和Herts/33 NP基因重组DNA质粒的结果Trizol法对病毒尿囊液进行总RNA提取，以随机引物反转录合成cDNA，通过La Sota和Herts/33 NP基因序列的特异性引物分别对NP基因进行扩增，结果显示在1470 bp处出现特异性目的片段（如图1A）。然后将目的片段回收并连入pGEM-T easy载体，连接转化并挑取单菌落扩增后，提取质粒进行双酶切鉴定，结果显示1470 bp处有特异性目的片段（如图1B）。再将目的片段回收并连入pVAX1载体，双酶切进行鉴定（如图1C）。

2.2 IFA检测重组质粒NP蛋白体外表达结果用构建好的重组质粒La-NP-pV、H33-NP-pV以及pVAX1载体转染Hela细胞，48 h后经过固定、透化和封闭处理，分别孵育一抗和二抗，以4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色，甘油封片剂封片后荧光显微镜观察结果（如图2）。结果显示：La-NP-pV、H33-NP-pV均呈现出特异性的红色荧光，而转染pVAX1载体以及未转染质粒的Hela细胞均未出现特异性红色荧光。结果表明：La Sota和Herts/33 NP基因重组DNA质粒均能在Hela细胞中表达目的蛋白。

图1 La Sota和Herts/33 NP基因重组DNA质粒的构建Fig.1 Construction recombinant DNA plasmid of La Sota, Herts/33 NP genes

图2 间接免疫荧光检测重组DNA质粒的体外表达Fig.2 Detection of transient expression of recombinant DNA plasmid by IFA

2.3 Western-blot检测重组质粒NP蛋白体外表达结果用重组质粒La-NP-pV、H33-NP-pV以及pVAX1载体分别转染293T细胞，48 h后收集细胞样品进行SDS-PAGE电泳，湿转并封闭后，分别孵育一抗和二抗，以ECL显色试剂盒显色，在X感光片下曝光。结果显示：La-NP-pV、H33-NP-pV在53 kDa处出现特异性目的条带，而转染pVAX1载体以及未转染质粒的293T细胞均未出现目的条带。结果表明：构建的La-NP-pV、H33-NP-pV重组质粒在体外真核表达系统中成功表达NP蛋白（如图3）。

图3 Western-blot检测重组质粒的体外表达Fig.3 Detection of transient expression of recombinant plasmid by Western-blot

图4 ELISpot检测预测表位多肽刺激免疫小鼠淋巴细胞产生IFN-γ斑点结果Fig.4 ELISpot results of the detection mouse lymphocytes specif c IFN-γspots produced by predicted epitopes stimulation

2.4 ELISpot检测免疫小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的结果La-NP-pV、H33-NP-pV重组质粒加强免疫C57BL/6小鼠10 d后无菌分离脾淋巴细胞，加入预先包被小鼠IFN-γ抗体的ELISpot 96孔板中，对不同免疫组分别加入预测的多肽刺激48 h后弃去细胞及培养基，加入检测抗体及AEC底物显色液，酶联斑点分析仪对ELISpot 96孔板进行数据读取及分析。结果显示：H33-NP-pV免疫组和La-NP-pV免疫组中FL-9、AL-8两条肽刺激脾淋巴细胞产生特异性斑点数量显著多于其他肽刺激产生的斑点数（如图4）。结果表明：FL-9、AL-8可以有效刺激La-NP-pV、H33-NP-pV重组质粒DNA免疫小鼠的淋巴细胞产生IFN-γ，生物统计学分析显示FL-9、AL-8两条多肽与阴性对照肽相比差异极显著（P＜0.01）。实验独立重复3次。

3 讨论

我们在前期抗原交叉提呈检测CD8+T细胞体外增殖试验中发现，NDV与DC及CD8+T细胞共培养期间，无论是NDV的强毒株Herts/33还是弱毒株La Sota都能抑制CD8+T细胞的增殖，而流感病毒H3N2可显著增加CD8+T细胞的数量（数据未给出）。这与已报道的副粘病毒科麻疹病毒（Measles virus，MV）、副流感病毒（Parainfluenza virus，PIV）、呼吸道合胞体病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）能够抑制T淋巴细胞的增殖是一致的[8]。而NDV作为副粘病毒科成员之一，其抑制细胞免疫应答的机制还尚未阐明。为了阐明这种免疫抑制机制，我们通过筛选T细胞表位多肽，获得功能性CTL表位。利用表位多肽能够在体外与MHC分子结合组装的特点，合成MHC-肽四聚体复合物，该四聚体复合物相当于TCR识别的配体，能够被特异性T细胞识别。当CTL表位多肽被DC捕获后，DC可通过吞噬、吞饮、巨胞饮等外源性抗原摄取方式将其内吞到胞内，然后直接由抗原加工相关转运体（transporter associated with antigen processing，TAP）转运到粗面内质网与MHC I类分子形成复合物，最后由高尔基体表达于细胞表面，激活CD8+T细胞的免疫应答是通过CTL表位多肽刺激产生的，其表面表达的TCR仅是针对CTL表位多肽的，通过偶联在MHC-肽四聚体上的荧光素，如异硫氰酸（FITC）、藻红蛋白（PE）等，用流式细胞仪对特异性增殖的CD8+T细胞进行检测[9,10]。理论上一个MHC-肽四聚体可以与四个表位多肽刺激产生的TCR结合，这种结合具有特异性和高效性。与MHC-肽单体相比，MHC-肽四聚体在亲和力、解离速度和生物效应方面都是最佳的。

本研究针对NDV NP蛋白预测了9条CTL表位，并通过动物实验筛选获得了2条功能性CTL表位，为合成MHC-肽四聚体提供理论依据，同时也为后续研究NDV与DC及T淋巴细胞之间的免疫抑制机制提供重要保障。

我们选用了ELISpot检测方法筛选CTL表位，ELISpot检测方法相对于传统的ELISA方法能够更加直观并客观地反映细胞因子的分泌情况，克服了只能从整体水平反应细胞状态的限制，它可以在单细胞水平上检测体液中游离的细胞因子或抗体。通过显色反应，细胞分泌的细胞因子或抗体在PVDF膜的相应位置上呈现出清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISpot分析系统对斑点进行统计，每一个斑点代表一个分泌细胞因子的细胞，由于是单细胞水平检测，所以ELISpot比ELISA更灵敏。

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LOCALIZATION OF RESTRICTED T CELL EPITOPES ON NP PROTEIN MHC CLASS I MOLECULES OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS

QIAO Chang-tao1,2, TAN Lei2, YU Sheng-qing2, QIU Xu-sheng2, SONG Cui-ping2, SUN Ying-jie2, HU Gui-xue1, DING Chan2
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The NP protein MHC I restricted epitopes of attenuated strain La Sota and virulent strain Herts/33 of Newcastle disease virus (NDV) were predicted using online analysis software for localization of cytotoxic T cell (CTL) epitopes. A total of 9 possible epitope sequences were identif ed and synthesized. The DNA plasmids were constructed to contain La Sota, Herts/33 strain NP genes and then used to immunize 4-week-old SPF C57BL/6 mice. A booster immunization was performed at day 21 post the f rst vaccination. Spleens of immunized mice were aseptically collected at day 10 post the second immunization and lymphocyte suspensions were prepared to detect IFN-γ secretions in ELISpot. Specif c spots of lymphocyte IFN-γ secretions were analyzed. Two out of 9 peptides showed signif cantly higher levels of lymphocyte IFN-γ secretions than irrelevance peptide (p＜0.01). As a result, two restricted T cell epitopes were determined on mouse H-2 kb. Information can be used for synthesis of specif c MHC-peptide tetramer for further investigation into the mechanisms of immunosuppression between NDV and dendritic cells (DC) and T lymphocytes.

Newcastle disease virus; NP protein; CTL epitopes; screening

S852.659.5

A

1674-6422（2014）01-0009-07

2013-11-07

上海市科技兴农重点攻关项目资助（沪农科攻字（2013）第3-7号）；公益性行业（农业）科研专项资助（201303038）

乔长涛，男，硕士研究生，预防兽医学专业

胡桂学，E-mail：huguixue901103@163.com；丁铲，E-mail：shoveldeen@shvri.ac.cn