透明质酸支架复合小鼠3T3-L1细胞及VEGF注射充填的实验研究

童芸 王晓芬 吴芳 郭梅菊 沈辉

透明质酸支架复合小鼠3T3-L1细胞及VEGF注射充填的实验研究

童芸 王晓芬 吴芳 郭梅菊 沈辉

目的 观察透明质酸（HA）支架复合小鼠3T3-L1细胞及血管内皮细胞生长因子（VEGF）注射充填后移植细胞的存活情况。 方法 体外培养细胞并诱导后分组，PCR法检测分组后的脂肪分化相关基因 [氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、转录因子CCAAT增强子结合蛋白α（C-EBP α）]的表达。根据移植物成分分为4组：实验组（3×106诱导后脂肪细胞+0．6mlPBS缓冲液+0．6mlHA+20ng/mlVEGF），HA对照组（3×106诱导后脂肪细胞+0．6mlPBS缓冲液+0．6mlHA），VEGF对照组（3×106诱导后脂肪细胞+1．2mlPBS缓冲液+20ng/mlVEGF），空白对照组（3×106诱导后脂肪细胞+1．2mlPBS缓冲液）。术后2、4、8周处死小鼠后取材，标本行形态学及病理学检查，并测定移植物质量及微血管计数。 结果 体外培养后各组小鼠PPARγ及C/EBP α条带密度相近。实验组较其他各组存活的细胞多，形态均一，坏死较少。2、4、8周实验组小鼠移植物质量均明显高于其他组，HA对照组均明显高于VEGF对照组及空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）；2、4、8周实验组小鼠微血管计数均明显高于其他组，VEGF对照组均明显高于空白对照组，HA对照组均明显低于VEGF对照组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。 结论 HA支架复合小鼠3T3-L1细胞及VEGF体外培养后移植入小鼠体内可以提高移植细胞的存活水平。

透明质酸 小鼠 3T3-L1细胞 血管内皮细胞生长因子

脂肪前体细胞（如小鼠3T3-L1细胞）是从脂肪组织分离出的脂肪干细胞分化出的早期脂肪细胞，通过诱导具有分化增殖的潜能。外源性血管内皮细胞生长因子（VEGF）可促进移植组织内的血管增生和脂肪细胞分化增殖，但需要持续作用组织才能起到较好效果[1]。透明质酸（HA）是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖，为双糖单位组成的直链高分子多糖，广泛存在于组织细胞基质中，具有优良的生物相容性和生物可降解性。HA的大分子网状结构通过与水形成氢键可结合大量的水，可以维持局部VEGF水平，同时其独特的三维结构使之成为理想的种子细胞的支架材料[2-3]。本文旨在通过实验研究探讨HA支架复合自体脂肪干细胞及VEGF注射充填的效果，以期为临床应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠3T3-L1细胞（国家传染病诊治重点实验室提供），6周龄雌性BALB/c小鼠24只（浙江大学动物实验中心提供）。胰岛素、地塞米松、甲基异丁基黄嘌呤（Sigma公司），VEGF165（Peprotech公司）。10%FBS的DMEM液（Sigma公司）。1∶100HA（施佩特，福瑞达公司）。

1.2 细胞复苏和培养 取冻存小鼠3T3-L1细胞，37°C水浴2min至完全溶解。22°C下800r/min离心5min。取沉淀，加入10%FBS的DMEM液10m1，在直径10cm细胞培养皿中37°C、CO2培养箱培养。观察细胞长满则进行传代，弃培养液，培养皿加入1.5m1胰酶洗涤消化30～60s，加培养液终止消化，22°C下800r/min离心5min。取沉淀，1∶3在直径10cm细胞培养皿中传代，37°C、CO2培养箱培养。

1.3 细胞诱导及PCR检测 0.5mmo1/L甲基异丁基黄嘌呤、10mg/L胰岛素、1μmo1/L地塞米松诱导细胞2d后，换10mg/L胰岛素培养继续培养2d，之后再换成10%FBS的DMEM液培养4d。诱导后细胞分为4组（见表1），取6孔板培养1周后，行PCR检测PPAR-g及C/EBP-α，内参为β-actin。结果采用琼脂糖凝胶电泳检测。PCR引物及序列见表2。

1.4 脂肪细胞复合组织移植 将24只小鼠随机分成4组，以1m1注射器，每只小鼠背部皮下，筋膜层以内，移植物各注射2点，每点注射量1.2m1。注射后可见皮丘，2点间距离1.5cm，防止融合。各组小鼠移植物成分见表3。1.5 取材及测定 术后2、4、8周采用颈椎脱臼法处死法处死小鼠，眼科剪打开移植物周围筋膜，完整剥离出移植物，肉眼观察色泽、质地。电子天平测量质量。之后标本分别进行HE组织染色和苏丹Ⅲ染色。在HE染色片上计数每个HP（200倍）下微血管的个数，取其平均值即血管密度。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

表1 细胞分组及成分

表2 PCR引物及序列

表3 各组小鼠移植物成分

2 结果

2.1 大体观察 2、4、8周取材见小鼠背部皮下脂肪组织淡黄色，质软，容易剥离。实验组、HA对照组均取到标本。

2.2 PCR结果 PCR产物大小：PPARγ 226bp，C/EBP α 214bp，β-actin 446bp。凝胶电泳图见图1。

图1 PCR产物凝胶电泳图（1：实验组；2：HA对照组；3：VEGF对照组；4：空白组）

由图1可见，各组内参β-actin条带均有显示，密度相似，大小符合446bp区间，证明结果可信。各组PPAR-γ、C-EBP α均有明显表达，所在区间分别符合226bp和214bp，可以认为是特异性条带，且条带密度均相近。

2.3 HE染色检查结果 HE染色切片表现为移植物外周有纤维包膜。实验组存活脂肪细胞较多，坏死灶较少，细胞较大排列均一，可见微血管生长（图2a）；HA对照组脂肪细胞形态较均一，坏死少，炎性细胞少量浸润（图2b）；VEGF对照组也可见部分坏死脂肪细胞，炎性细胞浸润较空白对照组减少，脂肪细胞大小不一（图2c）；空白对照组可见较多坏死脂肪细胞，炎性细胞浸润，脂肪细胞大小不一，存活较少（图2d）。

2.4 苏丹Ⅲ染色结果 对照组红染脂肪较少，排列不规则，大小不一，有局部纤维化（图3a）；实验组红染脂肪较多，坏死灶较少，细胞较大排列均一（图3b）。

图3 苏丹Ⅲ染色组织学检查（a：空白对照组；b：实验组；×200）

2.5 各组小鼠移植物质量的比较 见表4。

表4 各组小鼠移植物质量的比较（mg）

由表4可见，2、4、8周实验组小鼠移植物质量均明显高于其他组，HA对照组均明显高于VEGF对照组及空白对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；VEGF对照组与空白对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）。2.6 各组小鼠微血管计数的比较 见表5。

表5 各组小鼠微血管计数的比较（个）

由表5可见，2、4、8周实验组小鼠微血管计数均明显高于其他组，VEGF对照组均明显高于空白对照组，HA对照组均明显低于VEGF对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

体表软组织缺损、凹陷、萎缩是临床上常见的面部形态畸形，目前主要常采用自体游离脂肪注射移植、注射性材料充填、或手术植入固体生物代用品，但都有明显缺点。很多人工材料植入有一定风险，可能出现材料包膜破裂、移位、硬结、过敏等并发症。自体脂肪移植虽然并发症较少，但吸收率较高，HA及其它多糖类制剂（如几丁质）降解时间过快，影响临床应用效果。脂肪前体细胞是从脂肪组织分离出的脂肪干细胞分化出的早期脂肪细胞，通过诱导具有分化增殖的潜能[3-4]。早期脂肪细胞来源广泛，并且本身具有体外分裂增殖能力，培养后通过脂肪分化的3联诱导剂可分化为脂肪细胞[5-6]。

目前，临床上对脂肪间充质干细胞的研究已取得重大进展。Zuk等[4]从脂肪组织中分离出了一种多能干细胞，在不同的刺激下具有成脂肪、成软骨、成骨和肌原性及神经细胞的分化潜能，被称为脂肪来源干细胞（ADSCs）。作为一种间充质干细胞，ADSCs在细胞形态和免疫学表型上与骨髓干细胞很相似[5-6]。平均300m1脂肪组织可获得2×108～6×108个细胞，这表明以种子细胞替代终末细胞具有无可比拟的增殖优势。ADSCs通过一系列尚不明确的机制进入脂肪系分化，成为成纤细胞样的脂肪前体细胞，开始了脂肪分化。这些脂肪前体细胞不像骨髓间充质干细胞对培养基中FBS来源和质量有严格要求，在加有任何批号FBS的DMEM培养基中均能很好地扩增。在传代培养中，平均倍增时间为60h，并且保持稳定的倍增率直至13～15代，其中衰老和死亡细胞的所占比例也很少，这表明脂肪前提细胞体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。

3T3-L1可被经典的三联诱导剂诱导分化为成熟脂肪细胞。诱导剂包括异丁基甲基嘌呤（MIX）、糖皮质激素如地塞米松（DEX）和胰岛素。MDI诱导1h后，3T3-L1细胞产生一系列早期基因的表达，包括c-fos、c-jun、c-myc以及转录因子CCAAT增强子结合蛋白β和δ（C/EBPβ和C/EBPδ）。c-fos、c-jun、c-myc在诱导2～6h后消失；24h后出现饱和后有丝分裂，在诱导分化第2天，有丝分裂完成，随后出现特殊的生长抑制称为GD。该有丝分裂起着解旋DNA，使转录因子与相应的脂肪分化相关基因元件结合的作用[7]，此时仍处在低浓度水平的PPARγ和C/EBP α开始升高；在诱导分化第3天，前脂肪细胞开始表达后期标记并在之后的几天逐渐变成球形出现脂肪滴，最后进入终末分化阶段[8]。通过大量实验为脂肪前体细胞分化为脂肪细胞的重要通路建立了一个模型，C/EBPβ和C/EBPδ的表达诱导首先表现为PPARγ的表达，然后PPARγ与C/EBP s又一起激活C/EBPα的表达，最终PPARγ、C/EBP α分别启动脂肪分化相关的各种基因表达。在PPARγ缺失的纯合子胚胎干细胞中，可以产生正常含量C/EBPβ和δ，而C/ EBPα含量很低[9-10]，提示PPARγ可诱导C/EBP α的表达。实验研究表明，PPAR γ和C/EBP α之间存在一个正反馈效应环，促进相互的表达[11]。在此基础上，大量转录因子和活性蛋白作用与这条通路的各个环节影响脂肪分化过程。对PPARγ基因敲除和嵌合体小鼠的研究证明，PPARγ作为主要的转录因子，可以独立地起始整个脂肪诱导分化过程[12-14]。因此，可以通过PCR检测PPARγ和C/EBPα表达情况了解细胞脂肪分化的程度。

VEGF是血管生成的重要因子，它促进血管内皮细胞的增殖、血管增生、延长血管内皮细胞的寿命以及增加血管通透性和血管维持，但VEGF需持续作用于脂肪移植体及周围组织才能起到良好的效果[15]。HA是葡糖醛酸-N-乙酰氨基葡糖，为双糖单位组成的直链高分子多糖，广泛存在于组织细胞基质中，具有优良的生物相容性和生物可降解性[1]。HA的大分子网状结构通过与水形成氢键可结合大量的水，可以维持局部VEGF水平，同时其独特的三维结构使之成为理想的种子细胞的支架材料。HA是皮肤组织的主要成分之一，皮肤内只要含有足够量的HA就可以防止皮肤的衰老、脱水，抑制纤维化；而且可以促进创伤愈合，抑制胶原过度沉积而导致的瘢痕。但是作为皮肤支架其易于降解，为了延长其在创面的作用时间，减少降解率，可以将HA与其他天然高分子或者细胞成分复合[16]。

本文结果显示，诱导分化后的3T3-L1脂肪细胞移植后在小鼠体内前2周，主要以急性炎症反应包括血运的重建，脂肪细胞的坏死吸收以及转化为前脂肪细胞、炎性细胞浸润等，2周后随四周血管的长入，边缘血运的逐步建立，该部位细胞成活，中央部位细胞坏死吸收及纤维化，此时为慢性炎症反应，2～3个月后，随血液循环的完善，细胞营养充足，前脂肪细胞又分化为成熟的脂肪细胞。2、4、8周实验组微血管计数与各组有明显差异，HA组与空白组无明显差异，VEGF组与空白组有明显差异，表明VEGF可以促进移植物血管生长，且该促进作用与HA的缓释作用有关。实验组移植物质量逐渐下降，此过程为HA逐渐降解。由此可见该HA材料作为支架，VEGF缓释后产生效应时间＞2周。而移植组织血管形成的时间在2周左右。这期间可以缓释VEGF，使新生脂肪组织内血管有较好的增生条件，从而使新生组织获得充分血供，以利于其存活。单纯的脂肪细胞移植有较多的细胞由于缺少血运重建最终坏死被炎性细胞吸收形成纤维化，而缺少HA作为支架，单纯VEGF进入体内被迅速代谢降解，与空白对照组无明显差异；HA对照组与空白对照组差异有统计学意义，提示了HA本身作为一种支架，可能通过其他作用有利于诱导的3T3-L1脂肪前体细胞形成脂肪组织，该现象有待进一步研究。

此外，PCR结果显示各组内参β-actin条带均有显示，密度相似，大小符合446bp区间。证明结果可信。作为脂肪分化主要的转录因子，PPAR-γ、C-EBP α均有明显表达，所在区间分别符合226bp和214bp，可以认为是特异性条带。各组PPAR-γ、C-EBP α条带密度均相近，说明在体外各组表达无明显差异。由于VEGF只有在体内才能促进血管生长，故在体外细胞实验各组无明显差异，进一步证明了VEGF通过促进血管生长来促进脂肪存活，对3T3-L1细胞脂肪分化表达无直接影响。由移植物的生长情况可见，HA4～8周降解趋于平稳，形成的脂肪组织逐渐稳定，可以认为其内已经形成了较完善的血运，这些组织已经存活，提示降解时间长于4周的HA更适合作为VEGF的载体。

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The study of injection of 3T3-L1 preadipocyte and hyaluronic acid scaffold combined with VEGF

ObjectiveTo evaluate the effect of increasing the survival rate of mouse 3T3-L1 after transplantation with hyaluronic acid(HA)gel scaffold and vascular endothelial growth factor(VEGF)．Methods After cell culture and differentiation induction in vitro,gene expression of peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ)and CCAAT/enhancer-binding proteinα (C/EBP α)was tested．HA-VEGF group(3×106induced 3T3-L1+0．6ml PBS+0．6ml HA),HA group(3×106induced 3T3+0．6mlPBS+0．6mlHA),VEGF group(3×106induced 3T3+1．2mlPBS+20ng/mlVEGF)and control group(3×106induced 3T3+1．2mlPBS)were set up to transplant the components．The mice were executed after 2,4,and 8 weeks．Morphology and pathology evaluation were performed to exam the tissue specimen．The weight measurement of the tissue specimen and the microvessel counting were also performed． Results After culture and differentiation induction in vitro,the band density of PPARγand C/EBP α were similar between groups by PCR test．The HE and Sultan III staining result indicated that VEGF combined with hyaluronic acid transplantation group had regular cell size,more cell survival,less necrosis than other groups．After 2,4 and 8 weeks,Graft weight of HA-VEGF group was significant higher than other groups．Graft weight of HA groups was significant higher than VEGF group and control group．The results had statistical difference(P＜0．05)．After 2,4 and 8 weeks,the microvessel density of HA-VEGF group was significant higher than other groups．Microvessel density of VEGF groups was significant higher than HA group and control group．The results had statistical difference(P＜0．05)． Conclusion Intradermal injection of 3T3-L1 preadipocyte by hyaluronic acid scaffold combined with VEGF increases the rate of survival of transplanted tissue．

Hyaluronic acid Mouse 3T3-L1 preadipocyte VEGF

2014-01-23）

（本文编辑：欧阳卿）

321000 金华市中心医院整形美容中心（童芸、王晓芬、吴芳、郭梅菊）；浙江大学医学院附属第一医院（沈辉）