氨基酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

田 园，鲁华敏，周 波 *，钟海雁

（1.稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南长沙 410004；2.粮油深加工与品质控制湖南省重点实验室，湖南长沙 410004；3.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004）

红曲发酵历史悠久，关于红曲方面的研究主要集中在次级代谢产物的开发利用上，许多学者对红曲霉菌代谢产物种类及其功能性等方面做了较多研究，其中红曲色素是研究较多且应用广泛的主要次级代谢产物[1-2]。目前完全确定结构的红曲色素有十几种，其中发现并确定结构的红曲黄色素有六种，如安卡红曲黄素（ankaflavin）和红曲素（monascin）[3]、xanthomonasin A 和xanthomonasin B[3]、monascusones A和monascusones B[4]。红曲黄色素不仅因其较好的耐热性和耐酸性而广受食品生产者和研究者的喜爱，还具有一定的生物活性，如monascin及其衍生物对小鼠T细胞有免疫抑制作用[5]，能减低皮肤癌的出现几率[6]；ankaflavin通过调控细胞凋亡相关联的机制对癌细胞株有选择性细胞毒性等[7]，但因菌种的缺乏，有关红曲黄色素工业化生产的研究报道较少[8-10]。

本实验室通过物理化学诱变获得一株高产黄色素的红曲霉突变菌株（Monascus ankamutant）[9]，并对其合成代谢黄色素的特性进行了一定的研究，证实其合成代谢的黄色素是安卡红曲黄素（ankaflavine）和红曲素（monascin）[10-13]，这说明红曲霉突变菌株合成代谢红曲色素和橘霉素的机理跟其他红曲霉菌种合成代谢色素和橘霉素的机理基本一样。已有相关研究报告说明氨基酸对于红曲红色素和橘霉素的合成代谢是一个非常重要的影响因子[14]，且相关氨基酸在一定程度能与红曲色素发生一定的反应生成色素衍生物[15]，在本实验中，根据红曲色素和橘霉素合成代谢的相关报道[4，14，16-18]，来研究氨基酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响，希望能为红曲黄色素和橘霉素的合成代谢机理的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

红曲霉突变株菌（Monascus ankamutant）：华南理工大学生化工程研究室选育并保存。

1.1.2 试剂

玉米粉：市售；氨基酸（分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司；其余化学试剂均为分析纯：广州市化学试剂厂。

1.1.3 培养基

斜面种培养基采用麦芽汁琼脂培养基：琼脂20 g/L，麦芽汁浓度为6 °Bé。

种子培养基：玉米粉30 g/L，硝酸钠3 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，磷酸二氢钾4 g/L，pH 6.0。

发酵培养基：氯化铵15 g/L，可溶性淀粉70 g/L，葡萄糖20 g/L，玉米浆10 g/L，KH2PO45 g/L，初始pH 4.0。

培养基均121 ℃蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

2802SUV/VIS紫外可见光分光光度计：上海尤尼科斯科学仪器有限公司；C25KC型全温摇床：美国New Brunswick Scientific公司；SPX-250B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ER-180A 型电子天平：日本A&D公司；Aglient 1100高效液相色谱：美国安捷伦科技有限公司；Scientz IID超声波细胞破碎机：宁波新芝生物科技股份责任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子培养和发酵方法

斜面种在32 ℃培养2～3 d；种子液32 ℃、160 r/min培养2～3 d；摇瓶发酵条件为250 mL三角瓶装30 mL培养基，160 r/min、32 ℃培养7 d，所有发酵实验均三个平行，计算平均值。

1.3.2 分析方法[19]

胞外色价测定：取一定体积的发酵液，4 000 r/min离心20 min，上清液经定性滤纸过滤，滤液稀释至适当倍数，用分光光度计在波长410 nm下测定其OD410nm值，此值乘以稀释倍数即为胞外黄色素色价；在波长510 nm下测定其OD510nm乘以稀释倍数即为胞外红色素色价，色价单位用U/mL表示。

胞内色价测定：离心后的菌体沉淀用体积分数为70%乙醇抽提1 h，然后4 000 r/min离心20 min，上清液过滤，滤液稀释至适当倍数，测定其OD410nm，此值乘以稀释倍数即为胞内黄色素色价；测定其OD510nm值乘以稀释倍数即为胞内红色素色价，色价单位用U/mL表示。

总黄色素色价的计算：总黄色素色价（U/mL）=胞外黄色素色价＋胞内黄色素色价。

色调的计算：色调=黄色素色价/红色素色价。

细胞干质量（dry cell weight，DCW）的测定：吸取5 mL发酵液，4 000 r/min离心20 min，去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤，4 000 r/min离心20 min，去上清液，重复三次后沉淀于80 ℃烘箱中烘至质量恒定。

橘霉素的检测：5 mL 发酵液用5 mL体积分数为95%的乙醇抽提1 h，通过超声波细胞破碎机破碎后于4 000 r/min离心20 min，离心上清液通过滤纸过滤，滤液再用0.45 μm有机系膜过滤，吸取滤液20 μL来进行橘霉素色谱检测。

HPLC检测条件：Aglient 1100的高效液相，柱为Eclipse XDB reverse C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温28 ℃，检测器为紫外检测器（λ=254 nm）；流动相（用色谱纯磷酸调pH至2.5）为乙腈/水（35∶65），流动相流速为1.0 mL/min[20]，进样量20 μL。

以橘霉素质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，得到橘霉素测定标准曲线回归方程为：y=27.11x-70.647（R2=0.995 1）。

2 结果与分析

2.1 甘氨酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

图1 甘氨酸含量对红曲黄色素色调(A)及色价(B)和橘霉素(C)的影响Fig.1 Effect of glycine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由图1A及图1B可知，添加适量的甘氨酸有利于黄色素的合成代谢，从色价考虑，最适甘氨酸添加量为2g/L，此时发酵得到的总黄色素色价增加量分别是没添加甘氨酸发酵时的69.82%，再增加甘氨酸的添加量时，黄色素色价的增加趋势出现下降，且黄色素色调下降很快，这说明甘氨酸不仅有利于黄色素的合成代谢，也有利于红色素的合成代谢。综合色价及色调考虑，甘氨酸添加量1g/L为宜。

由图1C可知，添加甘氨酸能明显促进橘霉素合成代谢，当甘氨酸添加量为6 g/L时，橘霉素的合成代谢量是对照组的6.61倍，提高561%，橘霉素生成量为3.37 mg/L。在本实验中甘氨酸添加使得发酵液pH上升，橘霉素生成量上升，这说明甘氨酸可能参与了橘霉素的合成代谢，或许为橘霉素的合成代谢提供了结构骨架，至于具体原因有待实验的进一步讨究。

2.2 酪氨酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

图2 酪氨酸含量对红曲黄色素色调(A)及色价(B)的影响Fig.2 Effect of tyrosine content on Monascus yellow pigments hue (A) and color value (B)

由图2可知，添加酪氨酸对胞内黄色素的产量有明显的提高，但当酪氨酸添加量＞4 g/L时，黄色素产量呈现下降趋势。对于胞外黄色素而言，添加酪氨酸对其影响不明显。酪氨酸添加量为4 g/L时，胞内和总黄色素色价都达到最大，分别比没添加酪氨酸时高出44.10%和42.46%。同时随着酪氨酸的添加，黄色素色调呈现下降趋势，但都＞2。综合色价及色调，酪氨酸添加量4 g/L为宜。

结果表明，一定添加量的酪氨酸明显有利于黄色素的合成代谢且发酵液黄色素色调下降较慢，同时对橘霉素合成代谢影响不明显，发酵液中并没有检测到橘霉素，相比于甘氨酸而言，酪氨酸更适合于作为培养基中的一种底物来促进黄色素的合成代谢。

2.3 亮氨酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

图3 亮氨酸含量对红曲黄色素色调(A)及色价(B)和橘霉素(C)的影响Fig.3 Effect of leucine content on Monascus yellow pigments hue (A),color value (B) and cirtinin (C)

由图3可知，亮氨酸的添加对黄色素生成量和色调的影响不明显。当亮氨酸添加量为3 g/L时，总黄色素色价相比于没添加亮氨酸发酵时只高出5.94%。从色调和色价的综合来看，亮氨酸对红曲色素的合成代谢没有明显的促进或抑制作用。综合色价及色调考虑，不添加亮氨酸添为宜。

随着亮氨酸的添加，橘霉素的合成代谢受到一定的消除影响，如当亮氨酸添加量为6 g/L和1 g/L时，橘霉素生成量分别为0.36 mg/L和0.47 mg/L，分别是不添加亮氨酸发酵时橘霉素生成量的70.59%和92.16%，分别下降29.41%和7.84%（见图3C），但是至于具体影响原因可能是因为亮氨酸不利于突变菌株的生长而导致橘霉素代谢生成量下降，也可能是亮氨酸影响了相关酶的活性从而导致橘霉素的合成代谢受到一定的影响。

2.4 天冬氨酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

由图4可知，添加适量的天冬氨酸是有利于黄色素的合成代谢，当天冬氨酸添加量为1 g/L时，此时胞外、胞内和总黄色素色价分别高出没添加天冬氨酸时的29.30%、10.019%和12.29%。综合色价及色调考虑，天冬氨酸添加量1 g/L为宜。

实验结果表明，添加适量的天冬氨酸（1 g/L）是较有利于黄色素的合成代谢且发酵液黄色素色调也不会明显下降，但天冬氨酸对橘霉素的合成代谢不能起到明显的消除效果（见图4C）。当天冬氨酸添加量为4 g/L时，橘霉素生成量最大，为1.02 mg/L是不添加时的2.43倍。

2.5 其他氨基酸对红曲霉突变菌株合成代谢黄色素和橘霉素的影响

在本实验中还研究了几种氨基酸（如苯丙氨酸、组氨酸、缬氨酸、脯氨酸和精氨酸）对黄色素色价的影响，结果见表1。由表1可知，相比于没添加氨基酸发酵时的黄色素色价而言，随着各种氨基酸的添加量从1 g/L增加到6 g/L，黄色素色价减少量都≥20%，有些黄色素减少量甚至达到83.15%（如苯丙氨酸），结果都表明这些氨基酸对黄色素色价都有不利的影响。

表1 氨基酸对黄色素色价的影响Table 1 Effect of amino acid on Monascus yellow pigments color value

氨基酸不利于黄色素的合成代谢很可能是两个原因的结果造成，一是氨基酸对红曲霉突变菌株的生长造成不利从而影响了黄色素量的积累；最主要的原因是氨基酸从代谢途径上影响了黄色素的合成代谢，抑制了黄色素的合成从而导致黄色素色价下降。

就橘霉素而言，绝大部分氨基酸对橘霉素的合成代谢能起到一定的消除效果，结果见表2。并且随着氨基酸质量浓度的增加，橘霉素的合成代谢受到的抑制作用越明显，如添加缬氨酸使得橘霉素含量从0.88 mg/L到未检测出来，组氨酸的添加是最明显能消除橘霉素的合成代谢。

表2 氨基酸对橘霉素合成代谢的影响Table 2 Effect of amino acid on citrinin production by Monascus anka mutant

3 结论

不论从基因水平还是酶水平，氨基酸作为氮源对于红曲色素的合成代谢的调控十分复杂，尤其是有些氨基酸本身参与了色素的合成，如有报道亮氨酸的存在导致了红曲红色素的降解[21]，但是在本研究亮氨酸对红曲黄色素的合成代谢影响不明显，从色调上也并没有体现出亮氨酸对红曲红色素合成代谢有不利的影响。组氨酸、甘氨酸、酪氨酸和精氨酸有利于红色素的合成，可以通过副产物苹果酸的生成来解释，因为红色素的生成跟苹果酸的积累有关[22]。

最近研究报道在化学合成培养基条件下，添加不同的氨基酸来研究其对红色素和橘霉素合成代谢的影响，发现添加甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和组氨酸有利于Monascus ruberATCC 96218合成代谢红色素，同时能明显抑制橘霉素的合成代谢，谷氨酸、丙氨酸和脯氨酸能有利于橘霉素的合成代谢。组氨酸不仅能有利红色素的合成代谢，更能完全消除橘霉素的合成代谢，其归结于组氨酸形成的H2O2的功劳[14，23]。对于其他真菌毒素，如寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和皮壳青霉（Penicillium crustosum）中的赭曲霉素，氨基酸对其也有同样的效果[24-26]。在本研究中，除了酪氨酸和甘氨酸明显有利于黄色素合成代谢外，其余都不利于黄色素的合成代谢或影响不明显，尤其是组氨酸和精氨酸的添加非常不利于黄色素的合成代谢。半胱氨酸盐酸盐、苯丙氨酸、组氨酸、缬氨酸和脯氨酸能明显消除橘霉素的合成代谢，但是甘氨酸能促进橘霉素的合成代谢，其机理还不清楚，有待进一步研究，而其他的氨基酸对橘霉素的合成代谢影响不是很明显。本文作者认为氨基酸消除橘霉素的合成代谢主要有两个原因：一是氨基酸在代谢当中产生一些化学物质导致橘霉素的合成代谢受到不利影响，如组氨酸在代谢途径中产生了过氧化氢，破坏了橘霉素的化学结构，从而使得橘霉素含量下降[27]；二是因为氨基酸对橘霉素的合成代谢途径有一定的抑制作用。

从工业化生产黄色素角度考虑，通过添加4 g/L的酪氨酸不仅有利于Monascus ankamutant合成代谢黄色素，还能降低橘霉素的代谢生成量。

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