氯化铵对苹果白兰地挥发性香气成分的影响

康三江，张永茂，曾朝珍，张海燕，张霁红，张 芳

（甘肃省农业科学院 农产品贮藏加工研究所，甘肃 兰州 730070）

苹果白兰地是以苹果汁为原料经酿酒酵母发酵并蒸馏后得到的一种新型水果类白酒[1]。苹果白兰地的挥发性香气物质是构成其质量的重要因素，也是评价其内在品质的重要指标，香气的好坏直接影响着苹果白兰地的风味品质和消费者的选购心理[2]。ZHAO Y P等[3]对白兰地中的芳香物质进行鉴定，结果显示，在鉴定出来的109 种化合物中，最主要的呈香物质是酯类物质，其中2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、β-大马酮、反式-β-甲基-γ-辛内酯是最重要的呈香化合物。彭松[4]通过对红枣白兰地样品的分析得出，其挥发性物质主要为酯类、醇类、醛类、呋喃类、芳香族类、缩醛类和萜烯类。卢柯等[5]研究发现，构成荔枝白兰地香气特征的物质主要是酯类、醇类、酸类、少量的酚类及萜烯类化合物。

氮源是酵母生长所必需的营养物质之一，苹果汁中含有足够酵母生长所必需的碳水化合物，但其氮的含量较低[6]，氯化铵为酵母发酵所需的优质无机氮源物质之一。在发酵中添加适宜的氮源将会有利于酵母的生长及提高苹果白兰地的产量和质量。目前就关于氮源对酵母菌生长及发酵动力学研究较多，而苹果白兰地中氮源添加对其发酵挥发性香气成分形成的研究报道较少。本试验在前期优化发酵工艺的基础上制得苹果白兰地，通过顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extractions，HS-SPME）和气相色谱-质谱（gas chromatohraph-mass spectrum，GC-MS）法分别测定有无氮源添加苹果汁中发酵苹果白兰地酒的香气成分，比较二者异同，揭示氮源对苹果白兰地发酵挥发性香气成分的影响，对提高苹果白兰地酒的风味具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母1023和1620：中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；斜面培养基：采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基（马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然）；种子培养基：采用PDA液体培养基（装液量100 mL/250 mL，pH自然）；富士苹果：采自于甘肃庆阳西峰区；氯化铵（分析纯）：天津奥博凯化工有限公司；焦亚硫酸钠（分析纯）：天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

手动固相微萃取（SPME）进样器，100 μm聚二甲基硅烷（polydimethylsilane，PDMS）萃取头：美国Supelco公司；TRACE DSQ型气相-质谱联用仪：美国Finnigan公司；YXQ-LS-75G型立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；B204LED型生物显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；TD50002型电子天平：余姚市金诺天平仪器有限公司；Breville-BJE500F型榨汁机：澳大利亚铂富公司；ZHJH-C11128型超净工作台、2WY-2102型恒温培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；RE5205型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 菌种制备

将酿酒酵母保藏菌种转接于新鲜试管斜面，28 ℃培养48 h，4 ℃冰箱保存备用。从保存的斜面培养基中用接种环挑去6环菌苔接种于装有100 mL液体种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min摇床培养48 h，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 苹果白兰地酒发酵培养基的制备

在前期优化发酵工艺的基础上向苹果白兰地酒发酵基础培养基中添加250 mg/L氯化铵作为氮源并设置对照，分别装于1 000 mL三角瓶，每瓶600 mL，重复3次。

1.3.4 苹果白兰地酒精发酵

将活化好的两种酿酒酵母按照1∶1比例接种于600 mL苹果白兰地酒发酵培养基中，接种量为6%，接种菌含量为106CFU/mL，然后于20 ℃厌氧静置发酵6 d。

1.3.5 测定方法

样品处理：先将SPME萃取头在气相色谱的进样口老化1 h，老化温度250 ℃，取苹果白兰地酒8 mL置于15 mL钳口瓶中，加入2 g氯化钠，用聚四氟乙烯隔垫密封，放入电子恒温水浴锅中加热30 ℃平衡10 min后，通过隔垫将已老化好的100 μm PDMS萃取纤维头插在样品瓶中，保持在30 ℃恒温顶空吸附40 min后，插入GC-MS进样口，于250 ℃解析5 min。

采用TRACEDSQ型气相-质谱联用仪，DB-WAX弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）。

气相色谱条件：程序升温，起始温度45 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至230 ℃，保持7 min，进样口温度250 ℃，传输线温度230 ℃，载气氦气，流速1.0 mL/min，不分流进样方式。

质谱条件：电离方式电子电离（electron ionization，EI）源，电离电压70 eV，离子源温度200 ℃，质量扫描范围35～400 amu，发射电流100 μA，检测电压1.4 kV。

1.3.6 数据分析

数据处理采用Xcalibur软件，利用美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）08标准谱库自动检索各组分质谱数据，再结合相关文献及标准图谱[7]，采用色谱峰面积归一化法计算出苹果白兰地酒中各化学组分相对质量百分含量。

2 结果与分析

2.1 苹果白兰地GC-MS总离子流色谱图

采用顶空固相微萃取法和气相色谱质谱联用法对添加氮源及未添加氮源发酵苹果白兰地酒中的香气成分进行检测，得到可挥发性香气成分的保留时间（retention time，RT）及总离子流图，结果如图1所示。

图1 添加(A)和未添加(B)氯化铵发酵苹果白兰地中挥发性成分GC-MS总离子色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aromatic components in apple brandy with ammonium chloride (A) and without ammonium chloride (B)

2.2 不同处理发酵苹果白兰地香气成分分析

采用顶空固相微萃取，通过GC-MS对未添加（CK）和添加氯化铵发酵的苹果白兰地中香味物质进行了分析研究，结果如表1所示。

由表1可以看出，通过GC-MS分析，添加氯化铵发酵的苹果白兰地经鉴定共测得48种挥发性香气成分，其中酯类物质22种，相对含量为47.29%，醇类物质8种，相对含量为26.12%，羧酸类物质2种，相对含量为0.25%，烯烃类物质2种，相对含量为0.83%，烷烃类物质12种，相对含量为5.48%，其他香气物质2种，相对含量为0.22%；未添加氯化铵（CK）发酵的苹果白兰地经鉴定共测得54种挥发性香气成分，其中酯类物质22种，相对含量为42.55%，醇类物质8种，相对含量为31.95%，羧酸类物质4种，相对含量为0.77%，烯烃类物质4种，相对含量为1.01%，烷烃类物质12种，相对含量为5.59%，酮类物质2种，相对含量为0.09%，其他香气物质2种，相对含量为0.11%。

表1 苹果白兰地香气成分GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis of aroma components in apple brandy

续表

2.3 不同处理发酵的苹果白兰地主体香气成分对比分析

结合表1中苹果白兰地香气成分GC-MS分析结果，对苹果白兰地酒中几种主体香气成分的作用和相对含量作了进一步分析，结果如表2所示。

表2 苹果白兰地中主体香气成分相对含量Table 2 Relative content of key aroma components in apple brandy

表2结果表明，不论对照组还是添加氯化铵发酵的苹果白兰地中，酯类是苹果白兰地中含量最多的挥发性化合物，其中相对含量较高的酯类物质为乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯；挥发性酯是组成香气化合物的最重要种类，大多数酯类具有花、果香气，在酵母代谢产生的挥发性物质中，酯对酒的风味贡献最大[8-9]，如辛酸乙酯略带有玫瑰、橙子的花果香气，是白兰地酒特有的香味；癸酸乙酯具有葡萄的香气[10-11]。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和异丁醇、异戊醇被认为是构成香气的基本成分，而其他的挥发性组分只是补充、改善和修饰上述物质所构成的基本香气成分[12]，苹果白兰地的香气基本成分辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸乙酯及3-甲基-1-丁醇（异戊醇）在本研究中均被检出且相对含量较高，这与其他研究结果有相同之处。醇类是第二大类挥发性化合物，其中相对含量较高的醇类物质为3-甲基-1-丁醇、乙醇；一般醇类物质都会给人带来刺鼻的气味，在果酒中会给酒香带来负效应影响，3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香气，这种香气能够持久保持，所以常在食品工业和化工行业中用于调香[13]。综上所述，挥发性酯类和醇类物质是苹果白兰地挥发性香气物质的主要种类。

从表2还可以看出，虽然对照组与添加组在主体挥发性物质成分组成上具有一致性，但这些成分在相对含量上却存在一定的差异，添加组中总的酯类物质相对含量高于对照组，其含量分别为44.27%和38.61%；从单个酯类物质来看，除了己酸乙酯以外，添加组中主要酯类物质含量均高于对照组。

对于醇类物质而言，添加组的乙醇相对含量和对照组相比增加，而3-甲基-1-丁醇（异戊醇）的相对含量降低。异戊醇是高级醇的主要成分，但如含量过高，对人体有害，它的中毒和麻醉作用比乙醇强，能使神经系统充血，令人头痛，并且在体内的氧化速度比乙醇慢，在机体内的停留时间长[14]。有研究发现，外加氮源对高级醇的生成有很好的抑制作用[15]，本研究结果显示，添加外源氮可以提高苹果白兰地发酵酒精度和降低3-甲基-1-丁醇（异戊醇）的相对含量，这与有关报道研究结果相同，即培养基氮源不足，添加氮源可使高级醇含量降低。

3 结论

在苹果白兰地的挥发性物质中，酯类和醇类占的相对含量较高，构成了苹果白兰地的主体香气成分。

苹果白兰地发酵中添加氯化铵有助于提高主要酯类物质的相对含量，降低异戊醇的相对含量，其中相对含量较高的香气物质为乙酸乙酯、3-甲基-乙酸-1-丁酯、乙酸己酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、3-甲基-1-丁醇、乙醇。

本研究只是针对无机氮源对苹果白兰地香气成分影响方面做了初步研究。尚需进一步研究有机氮源、不同碳源、维生素等营养物质添加对苹果白兰地香气成分的影响。

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