大白菜对褐腐病抗性的快速鉴定方法研究

张耀伟， 苗国辉，2

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.大庆市萨尔图区农业局，大庆 163000）

大白菜对褐腐病抗性的快速鉴定方法研究

张耀伟1， 苗国辉1，2

（1.东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030；2.大庆市萨尔图区农业局，大庆 163000）

摘要为了建立一套大白菜对褐腐病抗性的快速鉴定方法，本研究对菌丝、菌核作为接种物进行了比较，并分析了菌丝浓度、接种苗龄、接种温度以及接种后空气湿度对褐腐病发病的影响。结果表明：菌饼回接土壤表面为最佳接种方法，菌丝浓度对致病力无影响；最佳接种苗龄为1～2叶期，最佳接种温度25℃，最佳接种湿度90%～100%；病情指数调查均在接种后第7天。

关键词大白菜； 褐腐病； 鉴定方法

褐腐病是大白菜生产中近几年逐渐发展起来的病害，在我国云南、华中以及东北地区均有发生，且导致大白菜不同程度减产；虽未发现大面积的暴发，但此病危害范围有蔓延扩大趋势。褐腐病主要危害大白菜的叶柄，导致叶柄腐烂，使大白菜品质降低，产量下降；并且在其运输、销售、贮藏过程中继续发病。

抗病育种是防治病害的最有效手段，其前提是明确病原菌、建立快速鉴定方法并依此筛选出抗性种质。苗国辉［1］、李宝聚［2］等人鉴定大白菜褐腐病病原菌为立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）。立枯丝核菌是一类广泛存在于自然界中的土壤习居真菌，能引起多种作物病害，在不同作物表现症状不同，在辣椒上表现为茎腐和根腐［3］，在白菜上表现为叶腐［4］。张丽对国内外有关立枯丝核菌进行归纳梳理，认为到目前为止，立枯丝核菌共划分为14个融合群、21个融合亚群［5］。苗国辉对采集自天津、黑龙江两地大白菜褐腐病上的立枯丝核菌，确定分属立枯丝核菌AG-2融合群和AG-1融合群［1］。

目前，对大白菜褐腐病病原菌已明确，但对大白菜褐腐病抗性鉴定的方法研究还没有报道。本试验研究不同接种物、接种方法、接种苗龄、接种温度、接种湿度等多个因素对苗期活体接种褐腐病病原菌后的大白菜褐腐病发病的影响。目的是建立大白菜对褐腐病的苗期快速鉴定方法，为筛选抗病种质和培育抗褐腐病的大白菜新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

由东北农业大学园艺学院大白菜研究室分离的立枯丝核菌TJ菌株（Rhizoctonia solani Kühn）［1］。

1.2 供试品种

研究接种方法对大白菜褐腐病发病影响所用9份材料在田间发病程度有显著差异，分别为‘CMS109’、‘C30’、‘C34’、‘A77’、‘A54-1’、‘A103-3-1’、‘A161’、‘A28-3’、‘A23-2’。

研究不同接种物、接种苗龄、接种温度、接种湿度对大白菜褐腐病发病影响，所用材料为田间发病较重的‘A54-1’。

以上品种均由东北农业大学大白菜研究室提供。

1.3 试验方法

大白菜育苗：育苗工作在封闭完好的防虫PC板温室内进行。所用营养土经高温灭菌，营养钵为8 cm×8 cm。种子充实饱满，发芽势一致，每钵2粒种子，覆土厚度0.7～1 cm，待子叶展平后，留1株。温度控制在30℃以下、15℃以上，自然光照。

1.3.1 不同接种方法对致病性的影响研究

将分离菌株接种于PDA平板上，在25℃黑暗下恒温培养5 d，用直径6 mm的打孔器打取菌饼接种于无菌苗的土壤表面、无伤口无菌苗软叶和叶柄上，每株接1个菌饼。其接种于无菌苗的土壤表面，苗龄为1～2叶期；接种无菌苗软叶上，苗龄为3～4叶期。接种无菌苗叶柄，苗龄为7～8叶期。昼∥夜温度为21℃∥18℃；昼∥夜光照为14 h∥10 h；湿度均是80%。每处理3次重复，每次重复18株。于接种5、7、9 d后进行病情调查，记载发病程度。并进行数据统计，最终确定最适接种方法。

1.3.2 不同接种物对致病性的影响研究

1.3.2.1 菌丝与菌核致病速率的研究

分离菌株接种于PDA平板上，在25℃黑暗下恒温培养5 d，用于打取菌饼。菌核是在25℃黑暗下恒温培养13 d，之后选取大小一致的菌核。

将已打好的菌饼和选好的菌核分别接种于苗龄为1～2叶期的无菌苗土壤表面，每株接1个菌饼或3个菌核。昼∥夜温度为21℃∥18℃；昼∥夜光照为14 h∥10 h；湿度80%。每处理3次重复，每次重复18株。接种5、7 d后，开始观察发病情况，并统计数据。

1.3.2.2 内围菌饼、外围菌饼致病性的研究

分离菌株接种于PDA平板上，在25℃黑暗下恒温培养5 d，用于打取菌饼。分别打取菌落外围边缘菌饼和菌落中心的菌饼。

将已准备好的内围菌饼、外围菌饼分别接种于苗龄为1～2叶期无菌苗土壤表面。昼∥夜温度为21℃∥18℃；昼∥夜光照为14 h∥10 h；湿度80%。每个处理3次重复，每次重复18株。接种5、7、9 d后进行调查，并统计数据。

1.3.3 大白菜对褐腐病抗性鉴定最佳接种苗龄的确定

本试验采取单因素试验，设3个水平：苗龄分别为1～2叶期、3～4叶期、5～6叶期，接种方法为1.3.1确定的最佳方法，接种物为1.3.2确定的接种物。昼∥夜温度为21℃∥18℃；昼∥夜光照为14 h∥10 h；湿度80%。试验在光照培养箱中进行，每个处理3次重复，每次重复18株，接种7 d后进行病情调查。

1.3.4 大白菜对褐腐病抗性鉴定最佳接种温度的确定

本试验采取单因素试验，设3个水平：温度分别为昼∥夜温度为29℃∥18℃、25℃∥18℃、21℃∥18℃；湿度为80%。昼∥夜光照为14 h∥10 h。接种苗龄根据1.3.3试验结果确定。试验在光照培养箱中进行。每个处理3次重复，每次重复18株，接种7 d后进行病情调查。

1.3.5 大白菜对褐腐病抗性鉴定最佳接种湿度的确定

本试验采取单因素试验，设3个水平：相对湿度分别为50%～60%、70%～80%、90%～100%。接种苗龄、温度分别根据1.3.3、1.3.4试验结果确定。昼∥夜光照为14 h∥10 h。试验在光照培养箱中进行。每个处理3次重复，每次重复18株，接种7 d后进行病情调查。

1.3.6 病情调查

（1）病情分级标准

根据预备试验，参照许志刚［6］的方法，确定单株病害分级标准。将单株的发病情况分为0级、1级、3级、5级、7级、9级。

0级：无病斑；

1级：0 cm＜病斑长度＜1 cm；

3级：1 cm≤病斑长度＜2 cm；

5级：2 cm≤病斑长度＜3 cm；

7级：3 cm≤病斑长度＜4 cm；

9级：腐烂或死亡。

注：接种软叶发病、接种土壤发病均采用上述病情分级标准。

（2）病情指数计算

病情指数H＝100×［（各级发病株数×病级）／最高发病级数×调查株数］。

1.3.7 统计分析

单因素方差分析，显著性测验采用新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同接种方法对致病性的研究

如图1a所示，将立枯丝核菌菌饼接种于根部土壤，发病初期下胚轴呈水浸状，后逐渐向上扩展至整个下胚轴，病部逐渐凹陷、缢缩，灰黑色；湿度大时水浸状腐烂，湿度小时被侵染部位表皮脱落，症状为立枯病病症。菌饼接种于叶柄，发病较快且初期为黄色水浸状病斑，后渐变为深褐色，最后叶柄腐烂，如图1b所示。菌柄接种于软叶，发病初期为褐色小斑点，后渐变为深褐色乃至黑褐色大斑，病斑逐渐扩大，湿度大时软叶腐烂，如图1c所示。

试验发现，将菌饼接种于软叶、菌饼接种于土壤致病症状相对稳定，菌饼接种叶柄上，发病不稳定，出现叶柄未被侵染或致病速率不一致，因此确定菌饼回接叶柄的接种方法与其他两种方法相比较，受外界环境影响较大，不适合作为鉴定接种方法。

图1 菌饼接种于‘A54-1’的不同部位发病症状Fig.1 Pathogenic symptom in different parts of‘A54-1’inoculated with the fungus cake

利用菌饼接种于软叶、菌饼接种于土壤的方法对9个大白菜自交系进行鉴定，结果见表1。试验结果表明，将菌饼接种于土壤表面，接种后5、6、9 d调查对不同品种病情指数排列顺序影响较小，对不同品种致病性稳定。将菌饼接种于软叶表面，接种后5、7、9 d调查对不同品种致病性呈现出很大差别，在不同接种天数内，不同品种的病情指数排列顺序相差很大，发病规律不一致。因此确定，将菌饼接种于软叶表面的方法对大白菜苗期抗性鉴定研究不可行，将菌饼接种于土壤的方法是科学的。

表1 菌饼接种于不同品种土壤表面和软叶表面后发病一致性分析1）Table 1 Comparison of disease index on different varieties after fungus cake inoculated to the soil and on the leaf

2.2 不同接种物对致病性的影响研究

2.2.1 接种菌饼与菌核发病速率的研究

由图2可以看出，在相同条件下，将菌饼接种于土壤先于菌核接种于土壤发病；接种5 d和接种7 d后，菌饼接种幼苗发病数均高于菌核接种的发病数，见表2。因此确定菌饼的致病速率快于菌核的致病速率。

图2 菌饼与菌核接种于土壤表面发病比较Fig.2 Comparison of pathogenic rate after cake and sclerotium inoculated to the soil

表2 菌饼与菌核接种于土壤表面发病率比较1）Table 2 Comparison of pathogenic rate after fungus cake and sclerotium inoculated to the soil

2.2.2 内围菌饼与外围菌饼致病性分析

由图3可以得出，在相同条件下内围菌饼与外围菌饼接种2 d时均已发病，且内围菌饼与外围菌饼发病症状相同。对接种后5、7、9 d病斑长度调查，结果表明内围菌饼与外围菌饼两处理无显著差异，见表3。

2.3 不同苗龄、温度、湿度对大白菜褐腐病发病的影响

2.3.1 不同苗龄对大白菜褐腐病发病的影响

从表4可以看出，接种苗龄为1～2叶期时病情指数最大，且与其他两个接种时期的病情指数呈极显著差异，说明苗龄越小越有利于病原菌的侵染，确定大白菜褐腐病的最佳接种苗龄为1～2叶期。

图3 内围菌饼与外围菌饼接种于土壤表面发病比较Fig.3 Comparison of pathogenic rate after fungus internal and external fungus cakes inoculated to the soil

表3 内围菌饼与外围菌接种于土壤病斑长度差异分析1）Table 3 Variance analysis of lesion length after internal and external fungus cakes inoculated to the soil

表4 不同接种苗龄发病病情指数差异分析Table 4 Disease index at different inoculation seedling stages

2.3.2 不同温度对大白菜褐腐病发病的影响

本试验采用已确定的最佳接种苗龄1～2叶期幼苗。从表5可以看出，接种温度为25℃∥18℃时病情指数最大，且与其他两个接种温度的病情指数呈极显著差异，说明相对于其他两个接种温度条件，接种温度为25℃∥18℃更有利于病原菌的侵染。

表5 不同接种温度发病病情指数差异分析Table 5 Disease index at different inoculation temperatures

2.3.3 不同湿度对大白菜褐腐病发病的影响

本试验采用已确定最佳接种苗龄1～2叶期幼苗，温度为已确定最佳接种温度25℃∥18℃。从表6可以看出，湿度不同对病原菌侵染幼苗有很大影响，在湿度为90%～100%时病情指数最大，且与其他两接种湿度条件下的病情指数有极显著差异，由此确定大白菜褐腐病的最佳接种湿度为90%～100%。

表6 不同接种湿度发病病情指数差异分析Table 6 Disease index under different inoculation humidity

3 结论与讨论

3.1 接种方法是抗性鉴定方法一个重要因素

对于大白菜苗期褐腐病抗性接种方法的研究尚未有报道，因此选出一种科学的接种方法至关重要。本试验中将大白菜褐腐病病原菌接种于土壤，幼苗发病症状符合苗期立枯病症状，说明大白菜褐腐病病原菌在苗期导致幼苗立枯病发生，这也与立枯丝核菌在其他作物苗期致病病状一致［5］。与其他两种接种方法相比较，菌饼接种于叶柄发病不稳定，说明在相同条件下菌饼接种叶柄受环境影响较大，这不利于后续试验进行。将菌饼接种于土壤表面，10个大白菜自交系在不同接种天数内的发病程度排序一致，表明采用这种接种方法，发病受到外界环境影响小、稳定、可行。

3.2 不同接种物对致病性的影响

前人研究表明菌丝和菌核均可以侵染幼苗导致幼苗发病，但尚未有报道说明菌丝与菌核侵染速率哪个更快、更稳定。试验表明，在相同条件下菌丝侵染幼苗的致病速率更快，可能是菌丝可以直接侵染幼苗，而菌核需要经过一段时间的萌发，待其长出菌丝后侵染有关；菌核萌发受环境影响较大，因此菌核接种法发病不稳定。

在培养基中生长的菌丝，从内到外的菌丝密度是不同的。本试验确定内围菌饼与外围菌饼的致病性无显著性差异，说明菌丝浓度不会因为菌饼位置不同而产生误差。

3.3 接种湿度、苗龄和温度对褐腐病发病的影响

接种苗龄、湿度和温度对于任何病害的快速鉴定都是重要因子。本试验表明，病原菌对不同苗龄幼苗的侵染速率有很大差异，1～2叶期接种发病程度最重，这与立枯病在苗期发病相吻合。其原因可能是苗龄越小其幼苗茎的表皮、皮层发育越不成熟，抵抗病原菌侵染的能力弱，从而易于受病原菌侵染。

本试验确定最佳接种温度为25℃∥18℃（昼∥夜），这与立枯丝核菌在25℃时，菌丝生长最快、菌丝层厚度最厚相吻合［1］，并与自然环境下苗期立枯病发病的温度相吻合。本试验确定接种后湿度控制在90%～100%时，病原菌侵染幼苗的发病程度最重，说明湿度越大越有利于病原菌的侵染，这与田间成株期发生褐腐病和苗期发生立枯病的环境条件一致。

参考文献

［1］ 苗国辉，闻凤英，张耀伟.津黑两地大白菜褐腐病病原菌鉴定及生物学特性的比较研究［J］.植物保护，2012，38（4）：89-95.

［2］ 周慧敏，谢学文，石延霞，等.大白菜褐腐病（茎基腐病）的病原菌鉴定［J］.中国蔬菜，2012（22）：70-74.

［3］ 何苏琴.引起辣椒茎腐和根腐的立枯丝核菌的生物学特性及致病性研究［J］.甘肃农业科技，2002（9）：44-45.

［4］ Yang G H，Chen X Q，Chen H R，et al.First report of foliar blight in Brassica rapa ssp.chinensis caused by Rhizoctonia solani AG4［J］.Plant Pathology，2004，53（2）：260.

［5］ 张丽.包菜立枯丝核菌球腐病的病原学研究［D］.武汉：华中农业大学植物科技学院，2008.

［6］ 许志刚.普通植物病理学［M］.第4版.北京：高等教育出版社，2009.

联系方式 E-mail：zhyw1271＠126.com

中图分类号：S 432.21

文献标识码：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.020

收稿日期：2013-06-06

修订日期：2013-11-18

基金项目：“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD02B01-13）

Methods for rapid identification of Chinese cabbage resistance to brown rot

Zhang Yaowei1， Miao Guohui1，2
（1.College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Agricultural Bureau of District Saertu，Daqing City，Daqing 163000，China）

AbstractIn order to establish a set of methods for rapid identification of Chinese cabbage resistant to brown rot，we compared the hyphae as inoculum with sclerotia，and analyzed the influence of seedling stage，temperature and air humidity on the occurrence of brown rot.The result showed that inoculation of fungus cake to soil surface was the best method，hyphae concentration was irrelevant to the virulence，the optimal inoculated seedling stage was 1－2 leaf，the optimal inoculated temperature was 25℃and the optimal inoculated humidity was 90%－100%，disease index was surveyed at seven days after inoculation.

Key wordsChinese cabbage； brown rot； identification methods