地衣芽孢杆菌高产2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

郭文逸 孙庆惠 宋丽娜 高松松 杨洪江

（天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

地衣芽孢杆菌高产2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

郭文逸 孙庆惠 宋丽娜 高松松 杨洪江

（天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

目前2，3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌，对人类健康和环境具有一定威胁。从牛奶样品中分离到1株产2，3-丁二醇的芽孢杆菌127-7，分析其16S rRNA基因序列，确定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。进一步对菌株127-7进行紫外诱变，筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。摇瓶发酵结果显示，突变株BL41的2，3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。对发酵副产物分析发现，不控制发酵液pH可以显著降低乳酸产量，2，3-丁二醇产量在72 h达到81.4 g/L。进一步调整补糖策略，维持最低残糖浓度为30 g/L，菌株BL41产2，3-丁二醇83.4 g/L，最高产率为1.9 g/L·h，发酵时间缩短至46 h。结果表明，地衣芽胞杆菌BL41可以作为候选菌株，用于工业规模2，3-丁二醇的生产。

地衣芽孢杆菌 2，3-丁二醇 紫外诱变 耐受葡萄糖

2，3-丁二醇是一 种重要的化工原料，广泛用于食品、化妆品、药物、塑料、卫生保健和能源等领域［1］。2，3-丁二醇脱水形成的甲乙酮是有效的燃料添加剂，并且其自身具有极高的燃烧值（27 198 J/g），优于甲醇（22 081 J/g）和乙醇（29 005 J/g），因此有望成为新能源的替代品［2，3］，但其化学合成工艺繁琐、污染严重，不符合绿色化工和低碳环保的要求。微生物法生产2，3-丁二醇是一种新型工业发展模式，对缓解我国目前的资源、能源及环境危机具有重要作用［4，5］。

目前，常见的生产2，3-丁二醇的菌种为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes），粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），多粘类芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）等［3］。其中以产酸克雷伯氏菌的研究较多，然而其为致病菌，对环境安全构成一定威胁［5］。

本研究首先分离产2，3-丁二醇的芽孢杆菌，然后进行紫外诱变，筛选到一株高产2，3-丁二醇的突变株，并进行发酵条件的优化，旨在进一步提高微生物法生产2，3-丁二醇的水平，筛选到更适于工业化生产的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

LB培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠10，pH7.0。肌酸筛选培养基（g/L）：底层包括葡萄糖 10，蛋白胨 10，玉米浆 5，硫酸锰 0.05，丙酮酸钠 5，氯化钠 5，琼脂20；上层培养基在底层培养基的基础上补加0.5%（W/V）的肌酸3 mL和7.5%（W/V）的甲萘酚3 mL，肌酸和甲萘酚在培养基灭菌后冷却至50℃左右时加入，用于筛选产乙偶姻菌株。葡萄糖筛选培养基（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠10，琼脂1.5，葡萄糖分别为170、180、190、200、210、220、230、240和250，pH7.0，用于筛选耐高糖菌株。MR-VP培养基（g/L）：蛋白胨7，葡萄糖5，磷酸氢二钾5，pH7.0，用于紫外诱变后，筛选高产乙偶姻菌株。种子培养基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉10，硫酸铵1，K2HPO41，pH7.0。发酵培养基（g/L）：葡萄糖100，酵母粉5，蛋白胨12，MnSO40.025，K2HPO43，硫酸镁0.2，乙酸钠5，pH7.0。除特殊说明，所有培养均在37℃条件下进行。

1.2 方法

1.2.1 产2，3-丁二醇芽孢杆菌的筛选 将牛奶样品80℃保温20 min，系列稀释后涂布在LB平板上，分离芽孢杆菌。将分离的单菌落点接在肌酸筛选平板的下层培养基上，培养48 h后，倒入上层培养基，约30 min后观察菌落颜色［6，7］。用接种针小心剥去上层培养基，挑选红色较深的菌落［8］，发酵培养72 h，利用气相色谱法，分析上清液中2，3-丁二醇含量。

1.2.2 分离菌株的分子鉴定 提取菌株基因组DNA［9］，以此作为模板，利用通用引物27F和1492R，扩增分离菌株的16S rRNA 基因片段［10］。PCR产物经纯化后进行序列测定，将所得DNA序列通过BLAST 检索，在GenBank的已知序列中进行同源性分析，确定与分离菌株同源程度最高的序列。

1.2.3 紫外诱变筛选高产2，3-丁二醇菌株 过夜培养分离菌株，菌液稀释后分别涂布在葡萄糖浓度为0-250 g/L的LB平板上，各浓度3个平行，确定分离菌株葡萄糖耐受浓度。将分离菌株进行紫外诱变，诱变后菌液稀释涂布于葡萄糖筛选平板上，黑布包裹培养24 h。选取直径较大的菌株接种到MR-VP培养基中，分别取18 h和36 h的发酵液，通过肌酸比色法计算乙偶姻产量［11］。筛选乙偶姻产量高的菌株进行发酵培养，利用气相色谱法测定48 h和72 h发酵液中2，3-丁二醇产量，筛选2，3-丁二醇高产菌株。

1.2.4 pH对2，3-丁二醇产量的影响 调节培养基酸碱度，分析发酵液pH与乳酸产量的关系。根据酸碱度，将培养基分为3组：第1组发酵液初始pH值为7.0，发酵过程中不控制pH值；第2组发酵液pH值维持在6.0；第3组发酵液pH值维持在7.0，发酵过程中每隔3 h，利用盐酸或氢氧化钠，调节发酵液的pH不变。试验在摇瓶中进行，两级种子培养后，转接于30 mL发酵培养基，150 r/min培养30 h。

根据上述试验结果，在5 L发酵罐中进行分批补料发酵，装液量为3 L，接种量为5%，通气量为2 vvm。高搅拌转速利于细胞的生长，然而2，3-丁二醇发酵是微好氧过程，不利于2，3-丁二醇的积累［12］，因此采用两步搅拌转速法，前期为400 r/min，14 h后降低转速，为200 r/min［13］。通过补加一定量的葡萄糖，使残糖浓度维持在15 g/L左右。

1.2.5 残糖浓度对2，3-丁二醇发酵的影响 底物浓度对发酵过程具有显著影响，提高发酵液中残糖水平，维持葡萄糖浓度为20-30 g/L时，可能有利于生成2，3-丁二醇［14］。为了确认这一猜测，在5 L发酵罐上进行分批补料发酵，其它条件不变，残糖浓度维持在30 g/L，分析2，3-丁二醇发酵水平的变化。

1.2.6 分析检测方法 使用紫外分光光度计测定OD600。将发酵液过滤后稀释100倍，采用生物传感分析仪SBA-40C测定葡萄糖、乳酸浓度。采用Aglient 7890A气相色谱仪检测2，3-丁二醇浓度，其中柱子型号：HP-INNOWax1909IN-213，色谱条件：起始柱温95℃保留2 min；然后以6℃/min升到150℃，保留0 min；最后100℃/min升到220℃，保留2 min；氮气、氢气和空气流速分别是2、30和300 mL/min。进样口和氢气火焰检测器的温度是260℃。

2 结果

2.1 产2,3-丁二醇的菌株筛选及鉴定

将LB平板上形成的菌落点接在肌酸平板上进行分析，12个菌落红色较深。将其发酵48 h，测量2，3-BD产量。结果（表1）显示，菌株127-7产2，3-丁二醇水平较高，为48.2 g/L。利用PCR方法扩增该菌株16S rRNA基因，测序后利用NCBI网站的BLAST软件进行比对，发现菌株127-7与多株B. licheniformis菌株高度同源，达到99%-100%，因此确定菌株127-7为地衣芽胞杆菌。将16S rRNA序列上传至GenBank，获得序列号为KF935264。

2.2 紫外诱变筛选高产2,3-丁二醇菌株

出发菌株127-7在葡萄糖浓度为250 g/L的LB平板上无菌落长出，此浓度作为筛选葡萄糖耐受菌株的条件。绘制菌株127-7的紫外致死曲线，紫外诱变时间为30 s，致死率达到87.1%。采用该条件，对菌株127-7进行诱变，涂布在含有250 g/L葡萄糖的筛选平板上，共得到2 406株突变子。

挑选菌落直径较大（＞1.5 mm）的突变子105株，进行肌酸比色试验，分别取发酵18 h和36 h的发酵液进行测定，分析乙偶姻含量。选取10株乙偶姻含量高的菌株，进一步分析2，3-丁二醇的产量。48 h发酵结果（图1）显示，突变子BL41、BL18、BL16、BL37、BL35和BL21，它们2，3-丁二醇产量均高于出发菌株127-7，占所挑选菌株的60.0%。其中，BL41的2，3-丁二醇产量比出发菌株高41.1%，转化率达到理论值的60.5%。

2.3 pH对2,3-丁二醇产量的影响

乳酸是2，3-丁二醇发酵过程中主要的副产物，为了分析培养基酸碱度与菌株BL41产乳酸水平的关系，进行了摇瓶试验。结果（表2）显示，将发酵过程pH始终控制在7.0 时，生成大量乳酸（21.0 g/L）；pH始终在6.0时，乳酸产量则显著减少，30 h后仅为0 g/L；培养基初始pH为7.0，发酵过程中不控制酸碱度，随着发酵的进行，pH不断下降，乳酸产量最终也为0 g/L。

所以在分批补料发酵中，选择发酵液初始pH值为7.0，发酵过程中不控制酸碱度这一条件。结果（图2）显示，72 h仅得到3 g/L的乳酸，2，3-丁二醇的产量则达到81.4 g/L。

2.4 残糖浓度对2,3-丁二醇产量的影响

葡萄糖浓度对2，3-丁二醇发酵具有一定的影响。图2显示，在葡萄糖浓度为30 g/L时2，3-丁二醇产率最高，为1.9 g/L·h，而随着葡萄糖浓度降低，产率也随之下降，推测发酵液中较低的葡萄糖浓度导致葡萄糖利用缓慢，产率下降，周期延长。为了验证这一假设，我们在分批补料发酵中，将残糖浓度维持在30 g/L。结果（图3）显示，2，3-丁二醇产量在46 h时即达到最高，为83.4 g/L，产率在22 h后一直维持在1.9 g/L·h左右，发酵时间明显缩短。发酵过程中，只有很低水平的乳酸产生。因此持续的高水平产率导致发酵时间变短。

3 讨论

地衣芽孢杆菌是常见的2，3-丁二醇生产菌株，它被美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration）认定为GRAS（generally recognized as safe）菌株，由于其不具有致病性，可以安全的用于大规模工业生产［13］。此外，地衣芽孢杆菌具有产生淀粉酶和木聚糖酶的能力，可以利用农业废弃物为原料发酵生产2，3-丁二醇，不仅可以降低生产成本，而且不与人类争夺资源［16］。但从目前报道来看，其生产能力普遍低于2，3-丁二醇生产优势菌克雷伯氏菌和粘质沙雷氏菌［17］。因此，努力提高芽孢杆菌生产2，3-丁二醇产量具有重要意义。

近年来，对2，3-丁二醇发酵菌种的选育，主要围绕着菌种的诱变筛选和基因工程的改造等［18］。本研究使用紫外诱变育种，是菌种选育研究中最常采用的方法，该方法操作简便，并且安全［19］。有研究表明提高菌株的耐糖性不仅可以提高2，3-丁二醇产量，还可以缩短发酵时间［20］。所以紫外诱变后，首先进行耐高糖菌株的筛选。乙偶姻是2，3-丁二醇的前体物质，通过筛选乙偶姻高产菌株，进而得到2，3-丁二醇高产菌株，而采用肌酸比色法分离筛选高产乙偶姻的菌株，大大减少了筛选的工作量。由此获得突变株BL41，通过摇瓶试验，2，3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。

发酵过程中pH是代谢活动的综合指标，是发酵过程中重要控制参数［21］，在混和酸发酵过程中，pH对发酵产物组成的影响尤其显著，直接影响碳源的代谢流向。碱性条件下，发酵有利于有机酸的形成，从而导致2，3-丁二醇合成量的减少。而酸性条件下，2，3-丁二醇的合成量较碱性条件下有明显上升，有机酸量则明显下降［22］。不同研究中，对培养基及发酵过程中的pH值采取了不同控制策略，可能会对2,3-丁二醇的产量产生影响［13，14］。而乳酸在pH为7.0-8.0是主要产物，在pH5.0-6.5时，2,3-丁二醇是主要的产物［1］。本研究中，控制pH为7.0时产生大量乳酸，而在pH为6.0和自然pH条件下，乳酸产量则显著减少。在分批补料发酵条件下，发酵过程中不控制pH，副产物乳酸的产量很低，碳源更多地流向2，3-丁二醇途径，产量达到81.4 g/L，显著地提高了2，3-丁二醇的生产效率。

采用不同的补料方式，对2，3-丁二醇的产量会产生不同的影响。针对菌株粘质沙雷氏菌H30的研究发现，采用恒底物浓度发酵方式，高残糖浓度（15-25 g/L）2，3-丁二醇的产量，高于低残糖浓度（5 g/L）［23］。以肺炎克雷伯氏菌SDM为生产菌株，发现与脉冲补料、恒速补料和指数补料相比，将葡萄糖浓度控制在20-30 g/L的恒底物浓度补料策略最为有效［15］。而地衣芽孢杆菌10-1-A，能够耐受高浓度葡萄糖，在残糖浓度为20-70 g/L之间时，能够维持2，3-丁二醇的较高产率［13］。本研究也发现，在分批补料发酵中，将残糖浓度维持在30 g/L时，可以长时间维持2，3-丁二醇较高的产率，使发酵时间缩短了26 h，提高了生产效率。

4 结论

本研究从牛奶中分离到1株地衣芽孢杆菌，经紫外诱变后，突变子BL41合成2，3-丁二醇的能力显著提高。进一步在5 L发酵罐中进行工艺优化，发现不控制酸碱度，可以明显减少乳酸的水平，碳源更多的流向2，3-丁二醇合成途径。另外，提高残糖浓度至30 g/L，2，3-丁二醇产量几乎不变，但发酵时间缩短26 h。结果显示，地衣芽胞杆菌BL41可以作为候选菌株，用于大规模生产2，3-丁二醇。

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（责任编辑 马鑫）

Breeding and Fermentation Characterization of Mutants of Bacillus licheniformis for 2，3-Butanediol Production

Guo Wenyi Sun Qinghui Song Lina Gao Songsong Yang Hongjiang
（Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）

Currently, most isolated 2,3-butanediol producing strains are pathogens and they cause certain risks to public health and environments. In this work,Bacillussp. 127-7 was isolated for 2,3-butanediol（BD）production from raw milk samples. It was identified asBacillus licheniformisby analyzing its 16S rRNA gene sequence. By UV-mutagenesis, mutants that could endure high glucose concentrations and produce relatively high amounts of acetoin were isolated for further analysis. In shake-flask fermentations, 2,3-BD production was increased by 41.1% in mutant strain BL41 compared with the parent strain 127-7. Additionally, BL41 yielded much less amounts of lactate acid in the cultures without acidity control and 2,3-BD reached 81.4 g/L in the fed-batch fermentation. Moreover, the minimal residual glucose concentration was incre ased to 30 g/L in the culture, the fermentation time was significantly reduced to 46 h with 83.4 g/L 2,3-BD. The highest productivity is up to 1.9 g/L·h. The results showed thatB. licheniformisBL41 may be used as a candidate strain for industrial production of 2,3-butanediol.

Bacillus licheniformis2，3-butanediol UV-mutagenesis Glucose tolerance

2014-01-23

郭文逸，女，硕士研究生，研究方向：工业微生物育种；E-mail: guowenyi000@163.com

杨洪江，男，博士，教授，研究方向：工业微生物育种；E-mail: hongjiangyang@tust.edu.cn