紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究

曹淑慧 周丽 崔文璟 刘中美 周哲敏

（江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究

曹淑慧 周丽 崔文璟 刘中美 周哲敏

（江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）

来源于紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的苯丙氨酸羟化酶结构简单，性质更接近于人的苯丙氨酸羟化酶，具有潜在的医药应用价值。从紫色色杆菌基因组中克隆得到苯丙氨酸羟化酶基因pah。构建重组表达载体pET24a-pah，并在Escherichia coliBL21（DE3）中实现高效表达。离子层析纯化后，重组蛋白比酶活高达503.2 U/mg。酶学性质研究显示，该重组酶的最适温度为40℃左右，50℃时PAH的半衰期为15 min；最适pH在7.5左右，在pH6-8范围内较稳定。37℃，pH7.5条件下，Km值为1.5 mmol/L，Vmax为0.5 mmol/min，kcat为5.05/s，催化效率kcat/Km为3.37 L/mmol·s。

苯丙氨酸羟化酶 紫色色杆菌 表达 纯化 酶学性质

苯丙氨酸作为一种必需氨基酸主要从食物中摄取，而人体内75%以上的苯丙氨酸代谢是靠苯丙氨酸羟化酶（Phenylalanine Hydroxylase，PAH，EC1.14.16.1）来完成的。哺乳动物体内的苯丙氨酸羟化酶主要存在于肝脏中［4］，若肝脏内的苯丙氨酸羟化酶表达异常就会造成苯丙氨酸代谢紊乱，从而引起苯丙酮尿症（PKU）的发生。目前，对于PKU的治疗主要通过控制饮食中苯丙氨酸的摄入量来减缓症状。但苯丙氨酸本身作为人体必需氨基酸之一是不可或缺的，长期的饮食限制可能增加饮食治疗后期并发症出现的危险，如骨质疏松、微量元素缺失。因此，如能将苯丙氨酸羟化酶通过口服或注射的方式输送到体内发挥作用就可以有效治疗由于苯丙氨酸羟化酶异常而引起的PKU。Yew等［14］通过将治疗分子封装到红细胞的临床手段构建PAH-RBCs，成功实现活性酶在血液中代谢苯丙氨酸。与直接静脉注射PAH酶相比，PAH-红细胞被消融时间显著延长。同时小鼠试验证实，PAH-RBCs的注入能使小鼠体内的苯丙氨酸下降80%。这为研究苯丙酮尿症的治疗方法指明了方向，同时也为该疾病的患者带来新的福音。

苯丙氨酸羟化酶是一种非血红素铁单加氧酶［1］。该酶与酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）、色氨酸羟化酶（tryptophan hydroxylase）同为芳香族氨基酸羟化酶（Aromatic amino acid hydroxylases，AAAHs）家族的成员，它们均能利用分子氧和来源于四氢生物蝶呤的电子对相应的芳香族氨基酸底物进行羟基化［3］。在苯丙氨酸羟化酶催化过程中，苯丙氨酸利用一分子氧和一分子四氢生物蝶呤，在PAH的催化下生成产物酪氨酸和一分子水，四氢生物蝶呤转化为二氢生物蝶呤（图1）。此外，铁离子是该反应的一种非必须的辅助因子。当亚铁离子不存在时，四氢生物蝶呤与氧气作用的产物过氧化氢就会积累，严重影响酶活，可通过添加过氧化氢酶来去除这种影响。当亚铁离子存在时，就会通过形成高价铁（Ⅳ）的形式留住一个氧分子，使过氧化氢不再产生，从而保障催化过程的顺利进行［6］。而高铁离子在最终将其携带的一个氧分子通过羟基的形式置换给苯丙氨酸使其变成产物酪氨酸，自身还原回亚铁离子的形式。现有PAH酶活测定体系添加了上述所有的辅助因子以及过氧化氢酶，使得该反应过程复杂，而精简反应体系，可便于其后续研究和应用。

苯丙氨酸羟化酶广泛存在于植物、动物和微生物中。紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶（CvPAH）结构简单，空间构象与人类苯丙氨酸羟化酶催化区域几乎完全一样，并且空间结构比人苯丙氨酸羟化酶更为松散，利于底物分子与活性中心的结合，同时热稳定性更好［5］，所以应用前景更为广阔。虽然早在1978年，Nakata等［10］就从紫色色杆菌中分离纯化出苯丙氨酸羟化酶，但只测得其沉降系数、斯托克斯半径、摩擦比、等电点等一些物理参数。Onishi等［12］通过抗原抗体相互作用的原理分离得到重组的CvPAH，纯化过程复杂，蛋白损失较高，不能满足其应用需求。同时，目前尚无系统性的CvPAH酶学性质方面研究的报道，该酶的测定过程也相对复杂。

由于大肠杆菌表达系统开发成熟、表达量高、效果稳定、表达产物分离纯化相对简单、是原核生物来源基因表达的首选宿主，本研究将来源于紫色色杆菌的苯丙氨酸羟化酶在大肠杆菌中进行高效表达，对重组酶进行分离纯化，高效制备该酶，并测定其酶学性质和酶学常数，优化酶反应体系，旨在为后续研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）购自Sigma（ATCC12540）（国药代理）公司。宿主菌Escherichia coliBL21（DE3）、克隆载体pUC19、表达载体pET-24a（+）为Novagen公司产品。

1.1.2 主要试剂与仪器 DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶等均购自日本宝生物工程（大连）有限公司，基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试剂盒均购自上海生物工程公司。AKTAXPRESS蛋白纯化系统（通用电气医疗器械集团）；DEAE，通用电气（中国）医疗器械集团。

1.1.3 培养基 2YT培养基（g/L）：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化钠5。营养肉汤培养基（g/L）：蛋白胨10，牛肉膏3，氯化钠5。

1.2 方法

1.2.1 紫色色杆菌基因组DNA的提取 将紫色色杆菌接种于营养肉汤培养基，26℃、150 r/min培养 25h 后收集菌体，用试剂盒（上海生工生物工程公司的EZ-10 spin column Genomic DNA Isolation Kit）提取基因组 DNA。

1.2.2pah基因的克隆

1.2.2.1 引 物 设 计 根 据GenBank提 供 的C. violaceum苯丙氨酸羟化酶基因序列（GeneID：AF146711）设计引物。用Primer 5.0软件设计引物，并在其上下游引入酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ（下划线部分所示）：Forward primer：5'-CGGGATCCATGAACGACCGCGCCGACTTTGTGG-3'；Reverse primer：5'-CCAAGCTTTCAGACGTCTTCGGTATC-3'。

1.2.2.2pah基因的扩增和克隆 PCR反应条件为：94℃预变性10 min；94℃变性1 min，56℃退火35 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃再延伸10 min。纯化后的PCR产物经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体pUC19上，转化E. coliJM109感受态细胞，挑取单菌落提质粒进行双酶切验证获得阳性克隆，并经测序验证。

1.2.3 PAH表达载体的构建 pUC19-PAH和pET-24a（+）通过BamHⅠ与Hind Ⅲ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化E. coliJM109感受态细胞，通过酶切验证，最终得到表达载体pET24a-pah。

1.2.4 PAH重组蛋白的诱导表达 将重组质粒pET24a-pah转化至感受态细胞E. coliBL21（DE3），获得PAH表达型重组大肠杆菌 BL21/pET24a-pah。挑取 BL21/pET24a-pah平板单菌落，接种于5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培养基，37℃、200 r/min过夜培养。取1 mL 上述过夜培养菌液接种于100 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培养基，37℃、200 r/min培养至菌液 OD600=0.6，加入IPTG诱导表达。1.2.4.1 IPTG诱导浓度优化 接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600=0.6，加入IPTG浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，24℃诱导24 h。

1.2.4.2 诱导时间优化 接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600=0.6，加入0.6 mmol/L IPTG，24℃诱导6、12、18、24、30和36 h。

1.2.4.3 最佳诱导温度 最佳诱导温度测定：接菌至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的2YT培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600=0.6，加入0.6 mmol/L IPTG，分别在12℃、18℃、24℃、30℃和36℃下诱导24 h。

1.2.5 离子层析纯化 离心收集菌体，重悬于20 mmol/L Tris-HCl中，冰浴超声破碎，离心收集上清用0.45 μm滤膜过滤。用HisTrap DEAE FF column 1 mL（GE公司）于AKTA AVANT层析系统中纯化上清中的重组蛋白［6］。

1.2.6 PAH重组酶的酶学性质分析 反应所得产物L-Tyr用 HPLC进行检测。色谱柱为La Chrom C18（5 μm，4.6×250 mm）；流动相为 10%（V/V）甲醇水溶液，洗脱10 min。荧光检测激发波波长为265 nm，发射波波长为315 nm，柱温40℃。所测得的产物峰面积换算为标准产物浓度，从而计算酶活［7］。

酶活定义：在 37℃，pH7.5的条件下，1 min转化底物 L-苯丙氨酸生成1 μmol L-酪氨酸所需的酶量为一个酶活力单位 1 U。

1.2.6.1 蛋白浓度测定 蛋白质定量采用常规的Bradford法［8］。

1.2.6.2 酶活测定体系确立 初始反应体系如表 1所示。在37℃下分别不添加苯丙氨酸（Phenylalanine）、PAH重组酶、DMPH4、过氧化氢酶（Catalase）、DTT、Fe2+检测其对酶活力的影响。以所有因子同时添加时的酶活为100%，作反应因子对酶活影响的柱状图［9］。

1.2.6.3 最适温度及温度稳定性 最适温度测定：分别测定在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃下重组酶的酶活力（pH7.5反应10 min），以反应温度对所测得酶活作图。

温度稳定性测定：在最适pH下，将50 μg的酶分别于20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃下金属浴保温0、15、30、45和60 min 后，加入底物于37℃，pH7.5测定残留酶活，作温度稳定性曲线。

1.2.6.4 最适pH及pH稳定性 最适pH测定：在最适温度下，分别测定pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下的酶活，以最高活力为100%，以各反应pH对所测得的相对酶活作图。

pH稳定性测定：在 25℃条件下将酶在不同 pH值（pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和 11.0）的缓冲液中处理12 h，然后在最适温度和pH下测定酶活，以最高显示的酶活力为100%，计算相对酶活，并对pH值作图。

1.2.6.5 酶的动力学参数测定 以不同浓度（0.2、0.4、0.8和1.0 mmol/L）的L-苯丙氨酸为底物，在最适条件下反应10 min，测定初始速率。采用双倒数作图法（Line weaver-Burk）计算Km及kcat值。

2 结果

2.1pah基因的克隆

通过PCR 方法扩增到紫色色杆菌pah的结构基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条约 900 bp的 DNA条带（图2-A），该片段大小与预期长度一致，说明已成功扩增出目的基因。连接pUC19载体后的重组质粒经DNA测序鉴定，序列与GenBank 所报道的紫色色杆菌来源的pah基因完全相同。将pah基因克隆于pET-24a载体BamHⅠ和Hind Ⅲ位点，构建重组表达质粒pET24a-pah。重组质粒经双酶切得到大小约为5.3 kb的pET-24a线性片段和大小约为900 bp的插入片段，证明原核表达载体pET24a-pah已成功构建（图2-B）。将pET24apah转入E. coliBL21（DE3），获得PAH表达型重组大肠杆菌BL21/pET24a-pah。

2.2 PAH在大肠杆菌中的表达与表达条件的优化

对诱导培养条件进行优化，SDS-PAGE电泳结果表明，最佳IPTG诱导浓度为0.6 mmol/L（图3-A），最佳诱导时间为24 h（图3-B），最佳诱导温度为24℃（图3-C）。所获得的蛋白分子量约为34 kD，与PAH（33 kD）加上T7-tag（pET-24a载体上共表达的标签）的理论值相符。

2.3 重组PAH的分离纯化

PAH重组酶经HisTrap DEAE FF column 1 mL阴离子柱纯化，SDS-PAGE凝胶电泳分析结果（图4）表明，一步纯化获得了较纯的目的蛋白，纯化后的比酶活相较纯化前提高了5倍左右，高达503.2 U/mg。各步的纯化效率如表2所示。

2.4 重组PAH的酶学性质

2.4.1 酶活测定体系的优化 通过37℃下对反应体系中各反应因子缺失后酶活力变化的检测可知：过氧化氢酶缺失对酶活几乎没有造成影响，Fe2+的缺失会对酶活造成一定的影响，而二硫苏糖醇DTT和辅因子四氢生物蝶呤DMPH4一旦缺失则会造成酶活完全丧失（图5）。优化后的反应体系为：1 mmol/L苯丙氨酸、50 μg PAH、200 μmol/L DMPH4、5 mmol/L DTT、5 μmol/L Fe2+，后续研究中采用该反应体系测定酶活。

2.4.2 最适温度及温度稳定性 重组酶在不同温度下的酶活（图6-A）显示，该酶的最适反应温度为40℃左右，超过50℃酶活有所降低，但是当温度低于20℃时则会引起酶活的急剧下降。为方便起见，后续反应中采用37℃作为PAH酶的反应温度。

20℃处理1 h酶活几乎没有变化；40℃热处理1 h后酶活残存85%左右。而50℃处理时间仅15 min就会造成酶活50%左右的损失（图6-B）。

2.4.3 pH对酶活力的影响 以100 mmol/L 的乙酸-乙酸钠体系作为pH4.0-6.0的缓冲体系，HEPES体系作为pH7.0-8.0的缓冲体系，碳酸钠-碳酸氢钠体系作为pH9.0-11.0的缓冲体系。不同pH的酶活测定结果（图7-A）表明，在最适反应温度下该酶的最适pH在7.5左右。pH稳定性分析（图7-B）显示，该酶在pH值6.0-8.0 范围内较稳定。

2.4.4 酶动力学参数 以L-苯丙氨酸为底物，在不同浓度下测定苯丙氨酸羟化酶的活性，从而计算出该酶的动力学参数。该酶的米氏常数Km为1.5 mol/L，最大反应速率Vmax为0.5 mmol/min，转化数kcat为5.05/s，催化效率kcat/Km为3.37 L/mmol·s。

3 讨论

紫色色杆菌PAH催化区域的空间构象与来源于哺乳动物的来源几乎完全一样，由于细菌酶所特有的高活性、高温度耐受性，使得其应用前景更为广阔。但目前该酶的表达量及制备水平远不能达到应用的需求。本研究将该酶在大肠杆菌中进行异源表达，获得了高表达量的PAH。纯化后PAH比酶活达到503.2 U/mg，比从原始菌中纯化出PAH的比酶活提高了近8倍，比Nakata等［10］的纯化更为简单。比Onishi等［12］通过抗原抗体相互作用分离出PAH的比酶活提高了3倍。

本研究发现反应过程中不添加过氧化氢酶对PAH酶活没有产生显著影响。而从已知的报道中可推测：在之前的反应体系中之所以添加过氧化氢酶是因为当亚铁离子不存在时，四氢生物蝶呤与氧气反应后会产生过氧化氢，过氧化氢酶的主要作用是将产生的过氧化氢分解以防过氧化氢对PAH酶产生毒害作用而使反应不能朝着正确的方向进行［6］。当亚铁离子存在时就可以阻止过氧化氢的产生，因而本研究在添加了亚铁离子的情况下，不需添加过氧化氢酶，从而使反应体系得到精简。这一结果对同类酶的测定过程也有一定的借鉴意义。

本研究将紫色色杆菌来源PAH的酶学背景研究的更为透彻。发现其最适反应温度为40℃左右，且在该温度下具有较好的热稳定性，虽然后续试验采用37℃作为PAH的酶的反应温度，仍可比Pember等［11］在25℃下进行反应获得更高的酶活和催化效率。可能是较高的温度有利于分子扩散。其最适pH在7.5左右，在pH6.0-8.0范围内酶活较稳定。重组酶的动力学参数与从紫色色杆菌中纯化出的野生型PAH的相一致。本研究为苯丙氨酸羟化酶进一步的理论研究和在PKU治疗中的应用奠定了良好的基础。

4 结论

本研究实现了紫色色杆菌pah基因在大肠杆菌中的高效表达（比酶活达到503.2 U/mg，比从原始菌中纯化出PAH的比酶活提高了近8倍）。通过对重组酶酶学性质及动力学分析，获得该酶的最适温度40℃左右、最适 pH7.5左右，重组酶的动力学参数与从紫色色杆菌中纯化出的野生型PAH的相似，kcat和Km的变化都不大。在pH6.0-8.0范围内具有较好的稳定性。

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（责任编辑 马鑫）

Heterologous Expression and Characterization of Phenylalanine Hydroxylase from Chromobacterium violaceum

Cao Shuhui Zhou Li Cui Wenjing Liu Zhongmei Zhou Zhemin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

Phenylalanine hydroxylase（PAH）derived fromChromobacterium violaceumhas potential pharmaceutical value due to its simple structure and the closer property to human PAH. We cloned thepahgene fromC. violaceumand constructed recombinant expression vcectors pET24a-pah, finally, thepahgene was efficiently expressed inEscherichia coliBL21（DE3）. The specific activity of recombination protein was 503.2 U/mg after purification. The studies of enzymatic properties showed that the enzyme displayed maximum activity at 40℃, and its half-life was 15 min at 50℃. The optimal pH was pH7.5, and the enzyme activity was stable at the range of pH6-8. Under the conditions of 37℃ and pH7.5, itsKmwas 1.5 mmol/L,Vmaxwas 0.5 mmol/min,kcatwas 5.05/s, and the catalytic efficiency（kcat/Km）was 3.37 L/mmol·s.

Phenylalanine hydroxylaseChromobacterium violaceumExpression Purification Enzymatic properties

2014-01-23

国家自然科学基金项目（31070711，31300087），新世纪优秀人才项目（NCET-10-0461），江苏省自然科学基金项目（BK20130131）

曹淑慧，女，硕士研究生，研究方向：发酵工程；E-mail：elizabethcsh@sina.com

周哲敏，男，教授，研究方向：生物酶学、发酵工程；E-mail：zhmzhou@jiangnan.edu.cn