尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽的cDNA克隆及真核表达载体的构建

刘晶晶 陶妍 文雅

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽的cDNA克隆及真核表达载体的构建

刘晶晶 陶妍 文雅

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

Hepcidin是一类由动物肝脏细胞表达，具有调节铁代谢功能并具有抗菌作用的小分子阳离子抗菌肽，富含半胱氨酸，它们在机体免疫系统中发挥了重要作用，被认为是抗生素的理想替代品。TH1-5属莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）3种Hepcidin cDNA序列中的一种。参考莫桑比克罗非鱼Hepcidin TH1-5的cDNA序列，以尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏Hepcidin全长 cDNA为模板，通过PCR扩增到编码22个氨基酸的类似于TH1-5的尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽片段“mTH”；通过设计含Xba I和Xho I酶切位点以及信号肽酶切位点的引物，将目的片段成功连接至pGAPZ-A真核表达载体，并转化进毕赤酵母菌GS115。经鉴定，重组真核表达载体“pGAPZ-A-mTH”已被成功构建，目的片段已整合进酵母染色体中。

Hepcidin 成熟肽 cDNA克隆 真核表达 毕赤酵母

抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP）是生物防御外来病菌时，在体内迅速合成的具有抗菌或杀菌活性的肽类物质。自从1972年瑞典科学家Boman等首先从惜古比天蚕蛹（Hyalophora cecropia）的免疫血淋巴中分离得到高效抗菌肽cecropin以来，至今已经有千余种抗菌肽被分离［1，2］，它们是一些内源性的具有广谱抗菌活性的天然小分子肽，广泛存在于生物体中，属非特异性免疫进化过程中的重要组成［3］。抗菌肽通常为碱性小分子，富含带正电荷的氨基酸，N端亲水，C端疏水，具有双亲性质［4］。此外，部分抗菌肽还能够耐胰蛋白酶或胃蛋白酶水解，并对真菌、原虫、病毒及癌细胞等具有一定的杀伤作用。因此，抗菌肽已越来越成为研究的热点。

Hepcidin又称LEAP-1（Liver-experssed antimicrobial peptide 1），是一种主要由肝细胞产生和分泌的小分子阳离子肽，具有广谱抗菌活性和调节铁代谢功能。其最初由Kruase等［5］从人血清中分离得到，之后又由Park等［6］从人尿液中分离到，然后从两栖动物和鱼类中亦发现了类似于Hepcidin的同源基因［7-9］。根据以往的报道，无论高等还是低等的脊椎动物，它们的Hepcidin成熟肽区域都含有6或8个半胱氨酸残基，在空间上能够形成3或4对二硫键，与其生物学活性有关。2007年，Huang等［10］确定了莫桑比克罗非鱼（Oreochromis niloticus）3种Hepcidin抗菌肽的全长cDNA序列，并化学合成了它们的3种成熟肽形式：TH1-5、TH2-2和TH2-3；其中，含22个氨基酸的TH1-5和含26个氨基酸的TH2-3显示了抗菌活性，而TH2-2则没有活性。然而，化学合成成本高，无法大量获得，重组DNA技术无疑是制备Hepcidin抗菌肽的最佳方法。

我们参考莫桑比克罗非鱼Hepcidin TH1-5的 cDNA序列，已经从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝脏中克隆到类似于TH1-5成熟肽的基因，并在大肠杆菌中实现了成功的融合表达，融合蛋白经肠激酶切割后释放出的重组肽“mTH”显示了对革兰氏阳性和阴性菌的良好抑菌活性［11］。但是，通过原核表达系统表达的目的蛋白经常以包涵体形式存在，产物纯化困难，且翻译后折叠修饰体系不完善，很难得到生物活性高的目的蛋白。众所周知，真核表达系统是适合于真核基因表达的良好的表达体系。据此，本研究以上述尼罗罗非鱼Hepcidin TH1-5的成熟肽为目标，选择pGAPZ-A为真核表达载体、XbaI和XhoI为限制性酶切位点，构建真核重组表达载体；并以毕赤酵母GS115为工程菌，构建真核表达体系，以期为获得真核表达的具生物学活性的尼罗罗非鱼Hepcidin 成熟肽奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 用于质粒复制和cDNA克隆的大肠杆菌菌株DH5α购自北京天根生物科技公司；克隆质粒pMD19-T购自TaKaRa公司（日本）；真核表达载体pGAPZ-A及毕赤酵母GS115购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司（美国）；ExTaqDNA 聚合酶、T4DNA连接酶、XhoI和XbaI限制性内切酶购自TaKaRa公司（日本）；质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、DNA分子量marker和蛋白质分子量marker购自北京天根生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对Hepcidin TH1-5成熟肽的cDNA片段添加酶切位点的PCR扩增 尼罗罗非鱼成鱼（体重0.3 kg）购自上海市浦东汇仑特种水产养殖场，其肝脏Hepcidin TH1-5的全长cDNA克隆同文雅等［11］。以此全长cDNA为模板，设计1个含XhoI酶切位点（单下划线区域）和信号肽酶切位点（双下划线区域）的正向引物H-MQF（5'-CCGCTCGAGAAAAGAGGCA TCAAGTGTCGC-3'）以及含XbaI酶切位点（单下划线区域）的反向引物H-MQR（5'-CTAGTCTAGATC AGAACCTGCAGCAAACTCC-3'），用于扩增Hepcidin TH1-5成熟肽的cDNA片段。PCR反应体系和条件如下：2.5 μL全长cDNA、各4.0 μL 10 μmol/L的正向和反向引物、1.0 μLTaq plusDNA polymerase（5 U/μL）、10 μL Taq plus Buffer、8.0 μL dNTP Mixture，用无菌水将反应液调至100 μL；94℃预变性3 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min；最终72℃延伸5 min，反应共进行30个循环。经DNA纯化试剂盒纯化的目的片段“mTH”与pMD19-T质粒按3∶1比例、在T4 DNA连接酶的作用下，16℃保温2 h，转化感受态细胞DH5α，37℃培养过夜；挑取经菌落PCR鉴定后确定的5个阳性克隆由上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。

1.2.2 Hepcidin氨基酸序列的多重比对及分子系统树的构建 用于多重比对的Hepcidin全长氨基酸序列来自NCBI网站，它们的序列号分别为：尼罗罗非鱼（nile tilapia，ID：AAU25840.2）、鲈鱼（perch，ID：AAT09138.1）、斑点叉尾鮰（channel catfish，ID：ABA43709.1）、长鳍叉尾鮰（blue catfish，ID：AAX-39714.1）、斑马鱼（zebrafish，ID：AAN10302.1）、鲢鱼（silver carp，ID：AGZ15358.1）、黄鳝（ricefieldeel，ID：ADK79123.1）、犬（dog，ID：AAT95397.1）、猪（pig，ID：AAM77745.1）、人（human，ID：NP_06-6998.1）、羊（sheep，ID：ADK56130.1）、家鼠（house mouse，ID：AAH21587.1）、狒狒（baboon，ID：ABU75213.1）、长臂猿（gibbon，ID：NM_001112914）、猩猩（orangutan，ID：NP_001127676.1）。分子系统树根据上述生物Hepcidin成熟肽的氨基酸序列构建，采用MEGA5.05临位相联法（Neighbor-Joinging），各结点的置信度由自引导值估计，重复次数为1 000。

1.2.3 pGAPZ-A-mTH真核重组表达载体的构建及阳性重组子的筛选 上述含“pMD19-mTH”重组质粒的阳性克隆经LB液体培养过夜后，用质粒小提试剂盒进行质粒提纯，然后对其进行XbaI和XhoI双酶切，反应体系和条件如下：“pMD19-mTH”重组质粒16 μL、10×Buffer 2 μL、XbaI 1 μL、XhoI 1 μL，37℃保温反应3 h后，用10×Loading Buffer终止反应，经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。另一方面，对pGAPZ-A真核表达载体进行同样的双酶切，酶切产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行DNA纯化。将含酶切位点的目的片段“mTH”与线性的pGAPZ-A载体按7∶1比例在以下条件16℃保温16 h：“mTH”片段7 μL、pGAPZ-A载体1 μL、10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL；连接液转化DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。挑取抗博来霉素阳性的单菌落为模板，正向引物和反向引物序列均来自pGAPZ-A载体，PCR反应条件同1.2.1，除了退火温度改为56℃。另一方面，对经菌落PCR鉴定的阳性重组子进行双酶切处理和电泳鉴定。挑取2个阳性重组子由上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。

1.2.4 pGAPZ-A-mTH真核重组表达质粒转化毕赤酵母GS115 重组表达质粒“pGAPZ-A-mTH”经BamH I酶切线性化后经DNA纯化试剂盒纯化，电转入毕赤酵母GS115，方法如下：将5-10 μL线性重组子加入80 μL酵母感受态细胞中，一并转入预冷的电转杯中，冰上放置5 min后进行电转，条件：1.5 kV、25 μF、200 ohm、5 ms；电转之后加入600 μL预冷的1 mol/L山梨醇，将此溶液转至1.5 mL EP管中，30℃静置1-2 h；采用含博来霉素0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的YPD平板筛选高拷贝工程菌；提取高拷贝酵母菌落的总DNA，以此为模板，采用载体上的通用引物，通过PCR检验目的片段是否与酵母染色体整合。

2 结果

2.1 添加限制性酶切位点和信号肽酶切位点的尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽的cDNA克隆

以尼罗罗非鱼肝脏Hepcidin全长cDNA为模板，通过设计含XbaI和XhoI限制性酶切位点以及信号肽酶切位点的引物，扩增得到1个85 bp的片段“mTH”（图1）。经DNA测序确证，上述酶切位点已被成功添加（图4-A），除去这些酶切位点，该片段编码了由22个氨基酸残基组成的Hepcidin成熟肽，8个保守的半胱氨酸残基位于成熟肽内。

2.2 尼罗罗非鱼与其他生物之间Hepcidin一级结构的氨基酸序列比较

采用Clustal W软件对尼罗罗非鱼Hepcidin与其他鱼类以及哺乳动物的Hepcidin一级结构进行比对，由图2可见，不同来源Hepcidin氨基酸序列显示了16个保守的氨基酸残基（灰色和黑色阴影），其中9个残基位于成熟肽区域内，尤其是与Hepcidin抗菌活性有关的高度保守的8个半胱氨酸残基（黑色阴影），由此证明成熟肽区域主要承担了Hepcidin的生物学功能。由表1可见，鱼类中，与尼罗罗非鱼同源性最高的是鲈鱼（perch），为86%；而哺乳动物与尼罗罗非鱼之间的同源性则都低于30%。

2.3 基于Hepcidin成熟肽氨基酸序列的分子系统树分析

由图3可见，在基于Hepcidin成熟肽氨基酸序列的分子系统树中，一共有3大组。两个大组分别属于鱼类和哺乳动物，分别由自引导值98和92支持；一个小组由尼罗罗非鱼和鲈鱼（perch）组成，由自引导值97支持，证明它们两者的亲缘关系最近，而与它们两者关系最近的是斑马鱼（zebrafish）。这些结果与上述基于Hepcidin全长氨基酸序列的同源性比对结果基本上是一致的。

2.4 pPICZ-A-mTH真核表达载体的构建及鉴定

将含XbaI和XhoI酶切位点的“mTH”片段与事先用这两种酶处理过的pGAPZ-A连接，得到重组表达质粒“pGAPZ-A-mTH”（图4-B）。通过菌落PCR鉴定，发现在约671 bp处有清晰条带（5-A），与理论相符，初步确定为阳性菌落；进一步对阳性菌落中的质粒进行提纯，通过XbaI和XhoI对质粒进行双酶切处理，经1%琼脂糖凝胶电泳后，发现存在大、小分子量的两条谱带，其中一条约85 bp的小分子量谱带属于目的片段（图5-B）。最终通过对阳性克隆的测序，证明目的片段“mTH”已正确连接至pGAPZ-A真核表达载体，并且核苷酸序列未发生任何碱基突变。另一方面，酵母菌总DNA的PCR结果（图6）。证明了经BamH I酶切线性化的重组表达质粒“pGAPZ-A-mTH”已顺利嵌合进酵母染色体中。

3 讨论

由于近年来水域环境严重污染，导致抗生素的过量使用，给水产食品安全带来了极大的隐患，因此，开发能够部分替代抗生素和提高水产生物免疫功能的天然抗菌剂势在必行。先天免疫机制是鱼类抵御感染的第一道防线，而抗菌肽在鱼类的免疫系统中起到了关键的作用。虽然昆虫来源和两栖动物来源的抗菌肽研究已有很多报道［12-14］，但对于鱼类来源抗菌肽的报道较少，至于鱼类抗菌肽真核表达方面的研究报道则更少。我们已经成功获得了基于大肠杆菌原核系统表达的具有良好抗菌活性的尼罗罗非鱼重组体Hepcidin成熟肽“mTH”。考虑到翻译后折叠、表达量、产物的后续处理等问题，本研究在原核表达的基础上，选择pGAPZ-A作为真核表达载体，该载体可随机嵌合进酵母染色体中，以获得高拷贝的重组转化子，有利于提高外源蛋白的表达量［15］；在结构上，它含有组合型的-GAP启动子和α-MF信号肽序列，无需甲醇诱导即可表达外源蛋白并能有效的分泌到胞外，防止了外源蛋白对细胞产生毒害作用。此外，它只需用博来霉素进行筛选，大大方便了操作，更适合于生产上大规模的制备。我们设计正向引物时，在其C端添加了信号肽的酶切位点，以确保表达产物在分泌到胞外时其N端的信号肽被自动切除，继而得到天然序列的目的蛋白。试验结果证明真核表达载体“pGAPZ-A-mTH”已被成功构建，酵母总DNA的PCR扩增结果也证明了目的片段已整合进酵母染色体中，为后期在毕赤酵母GS115中的表达奠定了良好的基础。

4 结论

本研究以通过RT-PCR获得的尼罗罗非鱼肝脏Hepcidin全长 cDNA为模板，参考莫桑比克罗非鱼Hepcidin TH1-5的cDNA序列，设计一对含XbaI和XhoI酶切位点以及信号肽酶切位点的引物，通过PCR扩增到编码22个氨基酸的类似于TH1-5的尼罗罗非鱼Hepcidin成熟肽片段“mTH”；目的片段被成功连接至pGAPZ-A真核表达载体，并转化进毕赤酵母菌GS115。经鉴定，重组真核表达载体“pGAPZA-mTH”已被成功构建。

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（责任编辑 李楠）

cDNA Cloning and Construction of Eukaryotic Recombinant Expression Vector for Hepcidin Mature Peptide from Tilapia（Oreochromis niloticus）

Liu Jingjing Tao Yan Wen Ya
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Hepcidin is a small cysteine-rich cationic antimicrobial peptide with the regulative function for iron metabolism. It is expressed predominantly in the liver of animals. Hepcidin plays an important role in the host’s immune response against microbial invasion. Thus, it is considered to be good substitutes for traditional antibiotics. TH1-5, one of the three different hepcidin cDNAs from tilapia（Oreochromis mossambicus）. The cDNA encoding hepcidin mature peptide（mTH）containing 22 residues was cloned from hepcidin full-length cDNA of tilapia（Oreochromis niloticus）liver by PCR. The forward and reverse primers were designed with reference to the nucleotide sequence of O. mossambicus hepcidin TH1-5. This cDNA fragment carrying Xba I and Xho I sites was inserted into pGAPZ-A plasmid with the same restriction sites to construct a recombinant expression plasmid “pGAPZ-A-mTH”. The colony PCR, Xba I and Xho I restriction endonuclease digestion and DNA sequencing demonstrated that the “pGAPZ-A-mTH” recombinant expression plasmid was constructed successfully. In addition, the recombinant expression plasmid was transformed into Pichia pastoris GS115 by an electroporation system. PCR using yeast DNA as template demonstrated that the recombinant expression plasmid was inserted into the yeast chromosome.

Hepcidin Mature peptide cDNA cloning Eukaryotic expression Pichia pastoris

2014-01-19

上海市教育委员会重点创新基金项目（11ZZ148）

刘晶晶，女，硕士研究生，研究方向：水产生物分子生物学；E-mail：liujingjing0424@foxmail.com

陶妍，女，教授，硕士生导师，研究方向：水产生物分子生物学；E-mail：ytao@shou.edu.cn