家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

魏川川 修江帆 王宇 国果 彭传林 吴沁怡 吴建伟

（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）

家蝇变应原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及诱导表达

魏川川 修江帆 王宇 国果 彭传林 吴沁怡 吴建伟

（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）

对家蝇变应原原肌球蛋白（Tropomyosin）基因进行同源克隆，序列分析；构建原核表达载体并在大肠杆菌中表达。从家蝇幼虫cDNA文库中筛选获得Tropomyosin基因。以该基因的cDNA文库质粒为模板，进行PCR扩增，获得家蝇Tropomyosin完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽、二级结构、三级结构、抗原表位和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒，转化到大肠杆菌OrigamiB（DE3）中进行诱导表达。Tropomyosin基因ORF全长828 bp，编码275个氨基酸，理论分子量31.6 kD；等电点为4.65，具有Tropomyosin家族的蛋白保守结构域。成功构建重组原核表达pEASY-E1-Tropomyosin并诱导表达重组蛋白。

家蝇 Tropomyosin 克隆 生物信息学 变应原

家蝇（Musca domestica）是世界性分布的蝇种，属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科，是我国大部分地区最常见、数量最多的一种媒介昆虫。其从幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境里，表现出极强的适应恶劣生存环境的能力，以机械性传播和生物性传播两种方式在人类和其它动物之间传播多种疾病，如痢疾、伤寒、霍乱等，但是家蝇自身鲜见被病原物感染的情况［1］，即使在高密度人工饲养的条件下也不会因大规模感染而死亡，说明家蝇有其独特的免疫防御机制，比生活环境单一化的昆虫更有效地抵御病原菌的感染［2］。

原肌球蛋白（Tropomyosin）是肌肉收缩过程中重要的调节蛋白质，广泛分布于各种真核细胞中，在许多无脊椎动物中都被鉴定为一种重要的过敏原，它能引起过敏性疾病。研究表明，家蚕［3］、疥螨［4］、甲壳类动物［5］和蟑螂［6，7］体内普遍存在原肌球蛋白，是一种过敏原。然而，蟑螂［8］和家蝇的粪及其肢体碎屑同样具有致敏性。斑马鱼原肌球蛋白基因，经免疫学鉴定发现其具有过敏原性［9］。

由于蟑螂重组变应原较天然蟑螂变应原更容易标准化，制备方便，Santos等［10］已经将重组的蟑螂蛋白应用于蟑螂的过敏诊断，并取得良好效果。研究表明，以重组变应原用于免疫治疗，可以显著降低患者的IgE结合能力，具有良好的治疗功效［11］。研究证实，重组过敏原可以达到甚至超过对应的抽提制备过敏原与人IgE结合的能力。在支气管霉菌性过敏症血清学诊断中，使用重组过敏原已经证实优于天然过敏原［12］。

本课题组在前期采用菌落活性染色法［13］，构建家蝇三龄幼虫热胁迫状态下的cDNA文库［14］，并从中筛选到一条Tropomyosin基因，经序列分析及BLAST比对，提示该基因为原肌球蛋白家族。本研究克隆出家蝇的Tropomyosin基因，并且在大肠杆菌中表达及进行生物信息学分析，旨在为进一步研究其免疫学功能及临床上脱敏治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 家蝇三龄幼虫为本实验室饲养，幼虫均重26.5 mg，饲养温度28℃，相对湿度65%，光照周期10N∶14D。

1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒（RNAiso PLUS）、逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、DNA标志物（DL2 000 DNA Marker）、pMD18-T 质粒、琼脂糖等购置于TaKaRa公司；pEASY-E1质粒购置于北京全式金生物公司，大肠杆菌 BL21（DE3）由中山大学病原生物学实验室馈赠，其余试剂购置于上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 总RNA的抽提按照TaKaRa公司的RNAiso PLUS说明书进行操作。总RNA经电泳检测，GeneQuant公司核酸定量分析仪测定A260/A280比值及浓度，选取A260/A280的比值范围为1.95-2.00的样本，以1 μg总RNA为模板，按照cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA第一链。

1.2.2Tropomyosin基因全长cDNA的获得 从课题组前期构建的家蝇三龄幼虫热胁迫cDNA文库［15-18］中筛选到克隆（002C03）进行测序，获得Tropomysin的 完 整ORF序 列， 运 用Primer Premier 5.0设计特异性引物。上游引物（Trop-F）：5'-ATGAAAATCGACAAGGATGCGGCC-3'，下游引物（Trop-R）：5'-TTATTCCTTGAGGATGAGCTCGACG-3'；进行PCR扩增。将其PCR产物纯化后亚克隆入pMD18-T载体，阳性克隆送上海生工生物公司测序鉴定。

1.2.3Tropomyosin基因的生物信息学分析 通过NCBI网站（http：//www.ncbi.blastX）对处于不同进化地位的其它物种Tropomyosin的同源蛋白序列进行序列比对，分析该基因蛋白的氨基酸序列与其他蛋白质氨基酸序列的相似性；用DNAclub软件分析cDNA 序列和开放阅读框；运用Signal P分析信号肽序列；运用EMBL-EBI的在线分析工具InterProScan 4分析蛋白保守结构域及活性位点；利用蛋白分析专家系统（Expert Protein Analysis System，ExPASy）的在线分析软件Protparam，分析预测蛋白质的氨基酸残基性质、分子量及理论等电点等；利用PREDICTPROTEIN在线分析软件预测蛋白质中包含的结构域和氨基酸功能位点；利用SWISS MODEL在线预测网站预测蛋白质的三级结构。利用PSORTⅡ在线分析网站分析蛋白质在细胞内的定位；通过IEDB Analysis Recource分析蛋白抗原表位。

1.2.4 家蝇Tropomyosin重组蛋白表达

1.2.4.1 pEASY-E1-Tropomyosin重组质粒的构建 以家蝇pMD18-T-Tropomyosin质粒为模板，进行PCR扩增，胶回收PCR产物。将纯化产物与pEASY-E1载体25℃连接10 min，并转化至感受态大肠杆菌Trans1-T1，挑取阳性克隆，放入含苄青霉素（50 mg/mL）的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒选用载体T7启动子上游引物（T7F）、T7终止子下游引物（T7R）及Trop-F、Trop-R进行PCR及测序鉴定。将阳性质粒转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性克隆，进行PCR鉴定，试验中所需的各引物序列见表1。

1.2.4.2 pEASY-E1-Tropomyosin重组蛋白的表达及鉴定 取过夜培养的菌液60 μL，加入含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、250 r/min 震摇约5 h至OD600=0.6，加入IPTG 诱导表达，取过夜诱导表达菌液，SDS-PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 家蝇Tropomyosin全长cDNA的获取

以家蝇三龄幼虫cDNA为模板，使用特异性引物进行RT-PCR扩增，所得产物经1.5%琼脂糖电泳鉴定，可见828 bp左右条带（图1）；经测序鉴定，证实获得家蝇Tropomyosin全长cDNA，该序列已上传至GenBank（登录号：KF974800）。

2.2 家蝇Tropomyosin基因的生物信息学分析

家蝇Tropomyosin基因编码区长度为828 bp，编码275个氨基酸（图2）。预测蛋白的理论分子量为31.599 kD，等电点为4.65。在哺乳细胞体内表达的半衰期为30 h；在酵母和大肠杆菌中体内表达的半衰期分别大于20 h和10 h。在溶液中的不稳定指数为39.06，预测在溶液中性质稳定。脂肪族指数86.73，总亲水性平均系数GRAVY-0.998，蛋白质总体疏水性系数高。

信号肽预测结果表明该蛋白不含信号肽，属于非分泌型蛋白。跨膜结构预测显示Tropomyosin蛋白没有跨膜区，PREDICTPROTEIN sec预测组成Tropomyosin多肽链的二级结构有2种类型，α螺旋（H）和无规则卷曲（L）的比例为98.55∶1.45，α螺旋占绝大多数。通过 Swiss-model 预测Tropomyosin蛋白的三级结构，结果（图3）显示，其结构为线性，主要由α-螺旋构成与二级结构预测所得结果能较好地吻合。保守结构域分析显示，家蝇Tropomyosin蛋白中含有Tropomyosin的功能域（1-272 aa），5个保守位点分别位于74-91 aa，110-130 aa，135-163 aa，165-188 aa，221-246 aa；活性位点位于222-230 aa，属于Tropomyosin家族。

亚细胞定位分析结果显示，其分布在细胞核的可能性为73.9%，分布在细胞骨架的可能性为17.4%分布在细胞质的可能性为4.3%，分布在线粒体的可能性为4.3%。

根据蛋白质抗原表位在线分析工具预测其主要线性抗原决定簇的位置分别是8-9 aa，14-35 aa，41-42 aa，44-51 aa，61-74 aa，89-98 aa，101-115 aa，125-133 aa，147-154aa，166-178 aa，199-213 aa，223-231 aa，244-245 aa，257-264 aa。

2.3 家蝇Tropomyosin重组质粒构建及蛋白表达

2.3.1 家蝇pEASY-E1-Tropomysin重组质粒的构建及鉴定 选用组合引物：Trop-F和Trop-R，T7F和Trop-R，Trop-F和 T7R，T7F和T7R进行菌液PCR鉴定重组质粒pEASY-E1-Tropomysin；提取重组质粒进行测序鉴定，与预期结果一致，确定插入片段连接方向正确。所构建的重组质粒的表达产物带有6个His标签，方便蛋白的纯化。

2.3.2 家蝇Tropomyosin重组蛋白表达 将鉴定为阳性的重组表达质粒导入到表达菌株BL21（DE3）中，经终浓度为2 mmol/L的 IPTG诱导5 h获得重组蛋白。SDS-PAGE 电泳分析（图4）显示，在约35 kD 处有外源蛋白表达条带出现（pEASY-E1载体His标签及部分载体蛋白大小约为3.2 kD），与预期分子量一致。而未经诱导菌株与空载体阴性对照菌在此位置确缺少该条带，表明目的蛋白重组表达成功。

3 讨论

自自然界中引起人们致敏的昆虫有蝇类、蛾类（如麦蛾、灯蛾）、蝶类、蟑螂等较多见。这些昆虫的肢体碎屑，鳞毛、排泄物、蜕皮、虫卵以及昆虫自身散发的特殊气味，均可成为吸入性致敏原，通过空气吸入而引起呼吸道过敏，亦有少数由昆虫叮咬、螯刺而引起严重的过敏休克。为了解除昆虫类致敏原对人类健康的危害，在临床上通常将致敏昆虫通过处理制作成为抗原，对过敏病人进行皮试，以查找过敏原。此法是变态反应临床工作开展特异性诊断、治疗的手段。故昆虫变应原疫苗的制备质量对于患者的临床诊断和脱敏治疗有着十分重要的意义［19］。

原肌球蛋白在许多无脊椎动物中被鉴定为一种重要的过敏原，例如屋尘螨，蟑螂［20］，鱿鱼，蜗牛和牡蛎［21］，并且相互之间有交叉反应［22］。然而，脊椎动物的原肌球蛋白虽然与无脊椎动物的原肌球蛋白有较高的同源性，却不引起过敏。

大肠埃希菌原核表达系统由于其遗传背景清楚、转化及表达效率高、成本低廉，被广泛地用于异源蛋白的表达。本研究选用的pEASY-E1 expression vector由pET载体改造而成，利用5 min快速TA克隆技术克隆PCR产物，无需酶切，无需纯化，直接克隆，提供氨苄青霉素筛选标记；利用T7lac启动子严谨调控、高效表达目的基因；其N端含有6-His蛋白纯化标签，便于采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱［23］进行重组蛋白纯化。

本研究成功克隆出家蝇原肌球蛋白基因的全序列，约为828bp，编码275个氨基酸，序列已上传至GenBank（登录号：KF974800.1），家蝇Tropomyosin蛋白中含有Tropomyosin的功能域（1-272 aa），5个保守位点分别位于74-91 aa，110-130 aa，135-163 aa，165-188 aa，221-246 aa；活性位点位于222-230 aa，属于Tropomyosin家族。蛋白质抗原表位分析Tropomyosin具有较强的抗原性，根据潜在的抗原表位，可以获得低致敏变应原，从而降低重组蛋白的致敏性，减弱脱敏治疗过程中可能诱发的过敏反应 。

此外，成功构建家蝇Tropomyosin的高效原核表达载体，得到相对分子质量为35 kD的重组原肌球蛋白，并进行相关的生物信息学分析。这将为后续家蝇原肌球蛋白的免疫学功能研究，以及由家蝇引起的变态性反应疾病的特异性诊断和治疗打下坚实的基础。。

4 结论

本研究克隆出家蝇原肌球蛋白基因的全序列，约为828 bp。成功构建家蝇Tropomyosin的高效原核表达载体，得到相对分子质量为35 kD的重组原肌球蛋白，并进行相关的生物信息学分析。

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（责任编辑 李楠）

Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Musca domestica Allergen Tropomyosin Gene

Wei Chuanchuan Xiu Jiangfan Wang Yu Guo Guo Peng Chuanlin Wu Qinyi Wu Jianwei
（Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

It was to probe into the homologous cloning of the Musca domestica allergen Tropomyosin gene, and then construct the prokaryotic expression vector which was expressed in Escherichia coli. Screening and isolation of Musca domestica Tropomyosin gene from Musca domestica cDNA library was carried out. The gene and encoded protein sequence of Tropomyosin was analyzed by bioinformatics methods , including general physical and chemical properties, signal peptide, secondary structure, tertiary structure, epitope and subcellular localization. Then plasmid pEASY-E1-Tropomysin were transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells for expression. The open reading frames of the Tropomyosin gene was 828 bp that encded a putative protein with 275 amino acids. The protein, with predicted molecular weight 31.6 kD and pI of 4.65, has the conserved Tropomyosin domain so belongs to Tropomyosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic expression vector pEASY-E1-Tropomysin was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli.

Musca domestic Tropomyosin Cloning Bioinformatics Allergen

2014-01-08

国家科技支撑计划（2011BAC06B12），国家自然科学基金项目（81360254），贵州省科学技术基金项目（黔科合J字[2012]2038号）

魏川川，男，硕士研究生，研究方向：昆虫分子免疫学研究；E-mail：752308241@qq.com

吴建伟，男，教授，博士生导师，研究方向：昆虫分子免疫学研究；E-mail：wjw@gmc.edu.cn