正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

冯丹宁德鲁陈少瑜李勇杰张艳丽吴涛陈海云

（1.云南省林业科学院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育与开发利用重点试验室 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点试验室，昆明 650201）

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

冯丹1，2宁德鲁1陈少瑜1，2李勇杰1张艳丽1吴涛1，2陈海云1

（1.云南省林业科学院，昆明 650201；2.云南省森林植物培育与开发利用重点试验室 国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点试验室，昆明 650201）

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物（UBC 886）、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响，建立其最佳反应体系。结果表明：25 μL的反应体系中5个因子的最佳水平为：Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，40次循环；72℃最后延伸7 min，4℃保存。

八角 ISSR-PCR反应 正交设计 体系优化

八角（Illicium verumHook. f.）是我国南方重要经济林木之一，其干果和茴油为我国传统的出口产品。同时，八角中的莽草酸是制造抗病毒药物奥司他韦的合成原料之一，特别用于流感的防治，2009年的H1N1新流感及2013年H7N9流感亦使用奥司他韦作治疗［1］。中国八角干果90%来自广西和云南，截至2011年底，全国八角干果年产量13.32万t，而广西、云南产量总和占全国总产量的93.62%［2］。因而，发展八角产业，对推动西部暖湿山区农民致富，改善生态环境具有重要意义。云南八角种质资源极为丰富，实生群体分布广泛，在早实、丰产、质优、抗性好的果实品质等方面具有丰富的多样性。这些丰富的种质资源不仅是新品种选育的物质基础，同时也是八角产业可持续发展的物质基础。科学合理地保护开发和利用这些丰富的种质资源，对八角产业的可持续发展具有重要的意义。

我国学者已从形态特征及分布、良种选育、栽培管理和病虫害防治等方面对八角做了大量研究工作［3-5］，利用分子生物技术对八角展开研究是近一年来才开始的，且仅限于用AFLP［6］和RAPD［7］进行八角遗传多样性分析。简单重复序列间区标记（ISSR）是一种在PCR中直接使用微卫星序列进行DNA扩增的分子标记技术［8］。由于ISSR技术具备操作简单、快速、高效、重复性好、耗资低等特点，近年来被广泛应用于植物的遗传连锁图谱构建、种质资源鉴定、基因鉴定和植物分类等各方面工作［9］。但是，对于不同的物种，反应体系的各因子的浓度将影响扩增结果。基于此，本试验选择云南省不同地区的八角作为试验材料，采用正交设计对反应体系中Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs等5个因子进行试验和分析，旨在摸索出一个适合八角ISSR-PCR反应的最佳体系，为八角今后相关的分子遗传分析工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于云南省文山州麻栗坡县、广南县和富宁县3个居群。DNA提取参照陈海云［10］的方法。用微量紫外分光光度计和0.8%的琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA进行检测，根据DNA模板浓度梯度稀释结果［11］，DNA模板浓度调至2×10-3ng/μL。随机从以上4个居群中分别取出两个单株，等量混合后作为ISSR-PCR反应的DNA模板。

TaqDNA聚合酶、MgCl2等试剂购自天根生化科技（北京）有限公司。引物参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的ISSR引物序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。经引物初步筛选，选择有扩增产物但效果欠佳的UBC886（3'-VDVCTCTCTCTCTCTCT-5'）作为ISSR-PCR体系优化引物。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR体系的正交设计 本试验采用5因素4水平正交试验设计［12］，TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物和DNA模板的各浓度梯度，见表1，正交试验共25个反应体系（表2）。反应总体积为25 μL，各体系中均加入2.5 μL的10×PCR buffer，其他各因素按表2加样，用ddH2O补足25 μL，用20 μL灭菌矿物油覆盖。

反应在Bio Rad C1000 Touch PCR基因扩增仪上进行。PCR扩增反应的程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，46℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环40次；72℃延伸7 min，12℃保存。

1.2.2 反应体系和扩增程序稳定性检测 扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为0.5×TBE，将扩增产物与溴酚蓝指示剂按照6∶1混合后取10 μL加入点样孔，以5 μL的D2000（天根）为Marker，120 V恒压电泳90 min，用Gene Genius Bio凝胶成像系统拍照分析。用3个不同种源的12个云南八角单株检测最佳反应体系和程序的稳定性。1.2.3 数据处理 根据电泳图为每个处理中的可识别条带赋值，将有条带记为“1”，无条带记为“0”，采用SPSS19.0进行极差分析和方差分析，同时参考条带的亮度和背景清晰度进行判断，选出最佳体系。

2 结果

2.1 正交试验分析

2.1.1 正交试验扩增的电泳图谱直观分析 八角ISSR-PCR正交试验电泳图如图1所示，由于不同处理间Mg2+、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs浓度不同，ISSR-PCR的扩增结果也有明显的差异。处理组合2、4、17、18和24扩增条带明亮，背景较为清晰。其中处理组合2（A3B3C1D1E4）和4（A3B1C4D4E1）的扩增主带明亮，背景清晰，表明这两个处理在八角ISSR-PCR反应体系的正交试验设计中效果最佳。

2.1.2 正交试验数据分析 根据电泳图为每个处理中的可识别条带赋值（表2），将有条带记为“1”，无条带记为“0”，然后对正交试验进行极差分析，结果见表3。极差分析中，Ki（i= 1，2，3和4）代表各因素同一水平下的条带数之和，R表示同一因素不同水平间的极差值。极差值反映了每个因素对ISSR-PCR 反应的影响程度，R值越大，说明该因素对试验结果影响越大。从极差R值可以看出，dNTPs和DNA模板对八角ISSR-PCR反应的影响最大，极差值为25；其次是引物，极差值为18；Mg2+和TaqDNA聚合酶的极差值均小于空白组的极差值，分别为16和17。各因素的主效应对八角ISSR-PCR反应影响的顺序为：dNTPs＞DNA模板＞引物＞TaqDNA聚合酶＞Mg2+浓度。

为进一步确定各因素对八角ISSR-PCR反应正交试验的影响，本试验利用SPSS19.0进行了方差分析和多重比较。结果（表4）表明，Mg2+浓度和引物对试验结果的影响达到显著水平（P＜0.05），而DNA模板、TaqDNA聚合酶和dNTPs对试验结果的影响未达到显著水平（P＞0.05）。多重比较结果表明，Mg2+浓度在水平1时，扩增条带少且背景模糊，与其他3个水平间存在显著差异，当Mg2+浓度达到2-4 mmol/L之间时，扩增条带较多，其中Mg2+浓度在3 mmol/L时，扩增条带明亮，背景清晰；引物浓度在0.6-0.8 μmol/L范围内时，扩增条带最多，结合主带亮度和背景清晰度等方面考虑，引物的最适浓度为0.8 μmol/L；TaqDNA聚合酶在1.5-2.0 U时对正交试验结果影响显著，但是结合极差分析中各因素对正交试验结果影响的排序，TaqDNA聚合酶的最适浓度为0.5 U。综上所述，在25 μL的八角ISSR-PCR体系中，5个因素的最佳组合为A3B1C4D4E1，即Mg2+浓度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L。

2.2 ISSR-PCR系统稳定性检测

根据正交试验和方差分析得到最佳优化体系（A3B1C4D4E1），随机选择12个八角单株（每个居群各4株）进行扩增，以便进一步检测该反应体系的稳定性。结果（图2）表明，12个单株均能获得清晰、多态性高、重复性好的条带，表明本试验正交设计优化八角ISSR-PCR反应体系稳定可靠。

3 讨论

目前，八角分子标记和基因序列方面的研究仅限于潘晓芳等［6］对八角属8个种和八角47个品种（类型）进行的AFLP遗传多样性分析，陈海云等［7］基于RAPD技术对云南23个八角优良无性系进行的遗传多样性分析，刘文倩等［14］用核糖体DNA内转录间隔区（ITS）序列对披针叶八角（I. laceolatum）进行的聚类分析。本研究初始根据已报道的八角属的地枫皮（I. difengpi）［15］和黄花八角（I. parviflorum）［16］ISSR反应体系建立八角ISSR-PCR试验体系时，未能得到理想的扩增结果，先通过单因素试验［11］获知八角DNA模板用量远低于普通ISSR-PCR反应体系时方能得到较为满意的结果。在此基础上，进一步通过正交试验设计获得了理想的扩增结果。

由于ISSR-PCR分子标记技术的扩增结果受引物、TaqDNA聚合酶、Mg2+浓度和dNTPs浓度等多种因素的影响，且各因素间又可能存在互作效应，因此确定最适八角ISSR-PCR体系就显得尤为必要。前人研究表明，DNA模板为102-105拷贝数时有利于ISSR-PCR试验［13］，所以，当本试验正交优化设计最终选用0.016 ng的DNA模板时，ISSR-PCR反应取得了较好的扩增效果。为获得重复性好、可靠性高的扩增谱带，本试验还通过正交试验对影响八角ISSR-PCR反应的其他4个因素Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶、引物和dNTPs在4个不同的浓度水平上进行了优化。Mg2+和dNTPs是TaqDNA聚合酶活性所必需的因素，两者之间能相互结合形成复合物，dNTPs浓度过低会降低PCR产物的产量，过高会造成浪费，且会降低Mg2+的有效浓度［13］。此外，引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度也是PCR特异性反应的关键，二者浓度过高可能产生非特异性扩增产物，而浓度过低则会影响扩增效果。总之，Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶、DNA模板、引物和dNTPs各因素对PCR反应的影响既独立又互补。因此，今后在设计正交试验时，不但应兼顾各因素主效应，同时还应该考虑各因素间可能存在的交互作用，以便获得条带明亮、背景清晰、可靠性高的扩增图谱。

4 结论

通过直观、极差、方差和多重比较，最终确定了处理4，即Mg2+浓度3 mmol/L、TaqDNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8 μmol/L和dNTPs 0.2 mmol/L为最佳的水平组合。

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（责任编辑 狄艳红）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System of Anise（Illicium verum Hook. f.）Based on Orthogonal Design

Feng Dan1，2Ning Delu1Chen Shaoyu1，2Li Yongjie1Zhang Yanli1Wu Tao1，2Chen Haiyun1
（1. Yunnan Academy of Forestry，Kunming 650201；2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants，Yunnan Laboratory for Conservation of Rare，Endangered & Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration，Kunming 650201）

Based on orthogonal design experiments, five main factors in ISSR-PCR amplification system, including Mg2+concentration, Taq DNA polymerase, DNA template, primer（UBC 868）and dNTPs, were studied to optimize the system for Illicium verum Hook. f.. The results showed that the optimized system was a total volume of 25 μL containing 3 mmol/L Mg2+, 0.5 U Taq DNA polymerase, 0.016 ng DNA template, 0.8 μmol/L primer and 0.2 mmol/L dNTPs. The optimal amplified procedure was started with predegeneration at 94℃ for 5 minutes, followed by 40 cycles of 30 seconds for denaturalization at 94℃, 45 seconds of annealing at 46℃, 60 seconds of extension at 72℃；7 minutes of extension at 72℃ and indefinitely remain at 4℃.

Illicium verum Hook. f. ISSR-PCR Orthogonal design Reaction system

2013-11-15

云南省“十一五”科技攻关项目（2006NG26），云南省自然科学基金项目（2010ZC234）

冯丹，女，硕士，研究实习员，研究方向：林木遗传育种；E-mail：fengdan1220@hotmail.com

陈海云，女，副研究员，研究方向：经济林良种选育及栽培；E-mail：kmchenhy@163.com吴涛，男，博士，助理研究员，研究方向：林木遗传育种；E-mail：ynafwt@126.com