金黄色葡萄球菌GapC蛋白与鼠伤寒沙门氏菌Flic融合蛋白的构建与免疫原性研究

赵 达，王 鹤，梁宏儒，胡 旭，姜东君，尹 辉，高佳滨，陈为宏，乔 波，朱战波

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种革兰氏阳性球菌，广泛分布于自然界中，在人和畜禽的皮肤、黏膜、肠道、呼吸道及乳腺中也有寄生，常引起化脓性疾病和毒素性疾病，是一种重要的人畜共患致病菌[1]。在感染性疾病中，S.aureus仅次于大肠杆菌，位居第二。随着S.aureus耐药菌株的出现，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，新型高效S.aureus疫苗的研发迫在眉睫。

GapC蛋白一种具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)活性的蛋白，研究表明人源和牛源S.aureus分离株表面均存在高度保守的GapC蛋白，并且具有高度的同源性[2-3]。本实验室前期研究结果证明S.aureus的GapC蛋白具有较好的保护力[4]。细菌的鞭毛蛋白是Toll样受体5(Toll-like receptor 5，TLR5)的配体，通过TLR5能够激发机体的天然免疫应答，从而发挥免疫佐剂作用[5-6]。Nguyen CT等[7]将鞭毛蛋白与肺炎链球菌的保护性蛋白PspA融合表达，诱导了高水平的抗PspA特异性抗体，并且该融合蛋白能够有效保护小鼠免遭肺炎链球菌的攻击。国内王鹤[8]、潘志明[9]的研究也证明了鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium,S.typhimurium)鞭毛蛋白的佐剂作用。

因此，本研究以鞭毛蛋白为佐剂，融合表达S.typhimurium鞭毛蛋白与S.aureusGapC蛋白，研究该融合蛋白的细胞、体液免疫反应及免疫保护性，为S.aureus疫苗的研制提供一定科学参考。

1 材料与方法

1.1菌株和实验动物S．aureus标准株Wood46株由黑龙江八一农垦大学预防兽医学实验室保存；6～8 w龄昆明系清洁级雌性小鼠，购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2质粒和试剂 质粒pQE30-Flic、pQE30-GapC和pQE30-Flic-GapC均由本实验构建；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；DMSO购自Amresco公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、TMB、刀豆蛋白A(ConA)购自SIGMA 公司；酶标板为Corning公司产品。

1.3试剂盒 Quick SpotTM小鼠IFN-γ、小鼠IL-4 ELISPOT预包被试剂盒为达科为生物技术有限公司产品；WST-1细胞增殖及毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.4重组蛋白的制备 诱导表达FliC、GapC、FliC-GapC重组蛋白，采用镍柱亲和层析的方法对重组蛋白进行纯化，在4 ℃条件下将所得纯化蛋白用PBS透析24 h以上，期间更换3～5次透析液。然后利用内毒素除去柱Detoxi-GelTM去内毒素。

1.5动物免疫 6～8周龄雌性昆明小鼠随机分为5组，每组20只，分别为GapC蛋白弗氏佐剂组(GapC蛋白+弗氏佐剂)、Flic-GapC蛋白组、GapC蛋白组、Flic蛋白组及PBS对照组。免疫剂量为100 μg/只，采用背部皮下注射免疫方式，间隔3 w免疫一次，一共免疫2次。

1.6小鼠血清中IgG抗体的检测 在免疫前进行一次割尾采血，分离血清，用作阴性对照血清；一免后每周采血一次，每组采5只，分离血清。方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度，间接ELISA测定小鼠血清抗体效价。具体步骤如下：用0.05 moL/L pH 9.6碳酸盐包被缓冲液将GapC蛋白稀释至适宜浓度，100 μL/孔，4 ℃包被过夜；用PBST洗涤3次后加入200 μL含5%脱脂乳的PBST溶液封闭，37 ℃ 2 h；PBST洗涤3次，将待检血清样品分别进行倍比稀释，同时设立阴性对照和空白对照，100 μL/孔，37 ℃ 1 h；PBST洗涤后，加入1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100 μL/孔；洗涤后加入新鲜配制的TMB显色液，100 μL/孔，室温避光作用15～20 min；50 μL 2 moL/L 浓硫酸终止显色；酶标仪检测OD450的值。样品OD 值≥阴性血清样品的OD 值+3s(s为标准方差) 时对应的血清稀释度为该样品的效价。

1.7淋巴细胞增殖反应试验

1.7.1小鼠脾脏淋巴细胞的分离和计数 取二免后14 d小鼠，每组3只，颈椎脱臼处死，75%的乙醇中浸泡2～3 min；无菌取出脾脏，加4～5 mL EZ-SepTMMouse 1×淋巴细胞分离液，用两个载玻片轻轻研磨；将细胞悬液转移至10 mL离心管中，加入1 mL无血清 RPMI 1640培养基；1 500 r/min水平离心10 min，轻轻吸出中间的淋巴细胞层，转移至另一10 mL离心管中，加入4 mL含5%犊牛血清的RPMI 1640培养基，颠倒混匀，1 500 r/min离心10 min，弃去上清，收集细胞；加入1 mL 10%犊牛血清的RPMI 1640培养基，重悬细胞，用0.4%台盼蓝进行计数；调整淋巴细胞浓度为2×106个/mL。

1.7.2T淋巴细胞增殖反应试验 于96孔细胞培养板加入淋巴细胞悬液，每孔50 μL。每个样品均设非特异性刺激(ConA)、特异性刺激(S.aureusGapC蛋白)和不加刺激物(RPMI-1640)孔，设3个重复孔。分别加入50 μL ConA(孔内终浓度为5 μg/mL)、S.aureusGapC蛋白(孔内终浓度为10 μg/mL)和RPMI-1640。同时在96孔细胞培养板上设置大于3孔的空白对照(只加100 μL 10 %血 清的R P M I 1640)。37 ℃ CO2培养箱孵育48 h，每孔加入10 μL WST-1，继续孵育4 h。取出培养板以空白对照孔调零，测量OD450的值，结果以3个孔的平均值表示。

计算刺激指数(stimulation index，SI)：

SI=(刺激孔OD-空白孔OD)/(未刺激孔OD-空白孔OD)。

1.8IFN-γ和IL-4的检测 采用Elispot方法检测二免后14 d小鼠脾脏IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞，以S.aureusGapC蛋白为刺激原(10 μg/mL)，整个实验设置一组正对照(PHA)，每一个细胞样品再设一个负对照(不加刺激物)，整块板设一个背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂)，试验中每个处理均设3个重复孔。具体操作步骤参考达科为Mouse INF-γ /IL-4 Precoated ELISPOT Kit试剂盒说明书。

1.9攻毒试验 在二免后21 d，对免疫组及对照组小鼠腹腔注射攻毒，每组10只，攻毒剂量为1 MLD(2×109CFU)。攻毒后在一周内每日观察小鼠死亡情况，分析各免疫组重组蛋白的保护率。

2 结 果

2.1重组蛋白的纯化结果 由于重组蛋白含有His-tag标签，所以采用镍柱亲和层析的方法进行纯化。纯化后的重组蛋白进行12% SDS-PAGE 分析，得到了比较纯净的蛋白，结果见图1。

2.2血清中GapC蛋白特异的IgG抗体检测结果 用ELISA 方法对各组小鼠血清中GapC蛋白特异的IgG抗体水平进行了检测。结果表明GapC蛋白弗氏佐剂组、Flic-GapC蛋白组在二次免疫2周后，抗体效价分别可达1∶128 000和1∶64 000。

分别对实验组和对照组的小鼠血清按1∶200稀释，进行间接ELISA试验，检测IgG抗体消长水平。试验结果表明，各免疫组从首次免疫后第3 w开始IgG抗体滴度均有不同程度的提高，且在二次免疫后两周抗体水平达至最高，然后缓慢下降，对照组无明显变化，如图2所示。

图1纯化后的重组蛋白SDS-PAGE电泳结果

M：蛋白质 Marker；1：纯化后的GapC蛋白；2：纯化后的Flic蛋白；3：纯化后的Flic-GapC蛋白.

Fig.1SDS-PAGEofpurifiedrecombinantprotein

M: Protein marker; 1: Purified GapC protein;

2: Purified Flic protein; 3: Purified Flic-GapC protein.

图2 小鼠免疫血清中抗GapC IgG抗体消长曲线

Fig.2Dynamiccurvesofanti-GapCIgGofimmunizedmouse

2.3T淋巴细胞增殖试验结果 以GapC蛋白和ConA为刺激原，检测小鼠二免后14 d淋巴细胞特异性增值情况，结果以刺激指数(SI)来表示，如表1和图3。其中GapC蛋白弗氏佐剂组、Flic-GapC蛋白组直接刺激指数差异无统计学意义(P>0.05)，但高于对照组。说明鞭毛蛋白具有刺激T淋巴细胞增殖的能力，但不如弗氏佐剂。

表1 免疫组及对照组鼠淋巴细胞细胞刺激指数(SI)

2.4IFN-γ和IL-4的检测结果 分离二免疫后14 d小鼠的脾淋巴细胞，并制成淋巴细胞悬液。利用Elispot方法测定免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的能力，免疫各组斑点数如图2-4所示。结果表明，Flic-GapC融合蛋白能诱导小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ，但诱导IL-4的能力相对较弱，但与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。

图3免疫组及对照组鼠淋巴细胞细胞刺激指数(SI)

Fig.3Lymphocytescellsstimulateindex(SI)ofvaccineimmunizedandcontrolgroups

图4免疫组及对照组鼠淋巴细胞细胞因子含量对比(SFC)

Fig.4Concentrationsofcytokinessecretedfromlymphocytesofvaccineimmunizedandcontrolmouse(SFC)

2.5攻毒保护试验结果 各蛋白免疫组及对照组实验动物在二免后21 d，用S.aureusWood46株攻毒。攻毒后连续一周记录实验动物的死亡状况，并从死亡小鼠内脏中分离到相应致病菌。结果表明，GapC蛋白弗氏佐剂组、FliC-GapC蛋白组攻毒试验结果保护率分别为80%和70%，单独的GapC蛋白组保护率仅为20%，FliC蛋白组以及PBS对照组保护率为0%。

3 讨 论

研究表明，细菌的鞭毛蛋白可以被细胞的Toll样受体5(Toll-like receptor 5)识别。鞭毛蛋白与TLR5受体结合后，启动骨髓源细胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖的信号转导途径，最终激活核内因子κB (nuclear factor-κB, NF-κB)和有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)。NF-κB的激活可引发前炎性因子的合成和释放，如 TNF-α，IL-6，IL-8，IL-10等，从而产生针对病原微生物的天然免疫应答[10-11]。

本研究中，我们利用鞭毛蛋白的免疫佐剂特点，融合表达S.typhimurium鞭毛蛋白与S.aureusGapC蛋白，结果在二免后，小鼠抗GapC蛋白血清抗体水平显著高于单独GapC蛋白组，稍低于GapC蛋白弗氏佐剂组。Karam MR等[12-13]成功表达了Flic同尿道致病性大肠杆菌粘附素FimH的融合蛋白，融合蛋白组抗体水平显著高于单独的FimH蛋白组。Huleatt JW等[14]将鞭毛蛋白与卵清蛋白(OVA)融合表达，诱导小鼠产生针对 OVA 的特异性免疫应答。本研究中血清抗体检测结果与上述研究结果一致，说明鞭毛蛋白在小鼠体内能辅助GapC蛋白产生较高的特异性抗体，Flic-GapC融合蛋白能够刺激小鼠的体液免疫反应。

正常机体的T淋巴细胞表面具有识别有丝分裂原和抗原的受体，在体外培养时，受到有丝分裂原(PHA或ConA)或特异性抗原刺激后，细胞可以发生增殖。本实验中即利用重组蛋白对小鼠免疫后，分离二免疫后14 d小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用GapC抗原刺激，测定其淋巴细胞增殖水平来检测T淋巴细胞的应答功能。结果表明，各免疫组平均刺激指数显著高于Flic对照组和PBS 对照组(P<0.05)，但GapC蛋白弗氏佐剂组和Flic-GapC蛋白组之间淋巴细胞刺激指数差异不显著(P>0.05)。说明鞭毛蛋白具有刺激T淋巴细胞增殖的能力。

ELISPOT方法具有较高的敏感性和特异性。本研究中以GapC蛋白为特异性刺激原，检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的能力。结果表明，用弗氏佐剂乳化GapC蛋白免疫小鼠后，脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL-4的能力最强，Flic-GapC融合蛋白次之，但与对照组相比差异仍然显著。说明鞭毛蛋白能够刺激TH1和TH2免疫应答，Flic-GapC融合蛋白也可以激发小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答。

小鼠攻毒保护试验显示，GapC蛋白弗氏佐剂组和Flic-GapC蛋白组具有具有一定的免疫保护效果，保护率分别为80%和70%，而单独的GapC蛋白组保护率仅有20%，对照组小鼠全部死亡。说明重组融合蛋白Flic-GapC具有良好的免疫原性，免疫小鼠后在一定程度上能够有效抵抗同源金黄色葡萄球菌的攻击，具有较好的免疫保护作用。但Flic-GapC蛋白与弗氏佐剂乳化后的免疫效果有待于进一步研究。

综上所述，Flic-GapC融合蛋白具有较好的免疫原性，能够诱发小鼠针对GapC蛋白的细胞和体液免疫反应，对金黄色葡萄球菌具有一定的免疫保护作用，可作为S.aureus的疫苗靶向进行深入研究。

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