猪链球菌2型中国强毒株05ZYH33 ofs基因敲除突变株构建及其生物学特性研究

李 敏，王 晶，史沛举，郭静静，杜骁杰，李先富，王长军，潘秀珍， ，高基民

猪链球菌2型(Streptococcussuis2，S.suis2)是一种危害全球的人兽共患病病原菌。该病原菌不仅可致猪脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎及心内膜炎等，而且还可感染人,给相关从业者和广大群众的生命安全造成严重威胁[1-2]。但目前S.suis2致病的具体机制仍不清楚。对于猪链球菌毒力因子的研究一直是一个热点，目前只有荚膜多糖(CPS)是唯一证明的主要毒力因子[3]。其它已知的与S．suis致病性相关的毒力因子有溶菌酶释放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶血素(suilysin，Sly)，二肽酶Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV)、烯醇化酶(Enolase)以及猪链球菌组氨酸三聚体蛋白(Histidine triad protein ofS.suis，Htps)等[4-9]。S.suis2的不同分离株致病性具有很大差异，可能与其毒力因子密切相关。猪链球菌血清浑浊因子(Opacity factor ofS.suis，OFS)是猪链球菌中新近鉴定的的一种重要的毒力因子[10]。本课题组前期通过对中国强毒株05ZYH33进行生物信息学分析，证实基因组中存在ofs编码基因(05SSU1663)，该基因位于基因组1575793-1578639 bp之间(基因全长2 847 bp)，并且对该基因的N-末端功能区域ofs37 - 683进行了敲除[11]。在此基础上,为了进一步研究ofs在S.suis2致病过程中的作用，我们以强致病株S.suis05ZYH33为研究对象,利用同源重组的基因敲除原理构建了ofs基因全长敲除突变株, 并通过猪链球菌2型感染BALB/c小鼠模型实验证实猪链球菌血清浑浊因子ofs基因全长缺失株对细菌毒力的影响，为进一步探究S.suis2新的致病因子及其致病机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株、质粒和引物 文中所用菌株和质粒以及引物见表1和表2。

表1 实验所用的菌株、质粒

表2 实验所用引物序列

1.1.2主要试剂和仪器 ExTaq DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、质粒DNA抽提试剂盒均为Takara公司产品；胶回收试剂盒为Promega公司产品，Todd-Hewitt Broth(THB)培养基为Difco公司产品；Gene Pulser XcellTM型电穿孔仪为Bio-Rad公司产品；Biodyne®B 正电荷尼龙膜(8 cm×12 cm)、CL-XPosureTM X 光胶片(5′×7′)、North2South®DNA 随机引物生物素标记试剂盒、North2South®化学发光杂交检测试剂盒为Pierce公司产品； parafilm 膜和WB506 型杂交袋为上海西唐生物科技有限公司产品；Whatman 3MM 滤纸为Whatman公司产品；显影粉和定影粉为江苏广达摄影材料厂产品；核酸杂交仪为HYBAID公司产品；Ultrospec2000型紫外分光光度计为Pharmacia公司产品。

1.1.3实验动物 BALB/c小鼠( SPF 级) ，雌性，4周龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.205ZYH33ofs基因敲除突变株的构建和鉴定

1.2.1基因敲除载体的构建 以S.suis2 05ZYH33基因组DNA为模板，用引物对LA1 /2、RA1 /2分别扩增ofs基因的上下游DNA片段LA及RA; 同时以pSET2质粒为模版，用引物Spc1/2扩增壮观霉素抗性基因(spcrcassette)。分别将LA、RA片段连接到 pMD-18T上，将Spc片段到pUC18上。在限制性内切酶EcoR I和BamH I及T4DNA连接酶的作用下，将LA连接到pUC18-spc上，再利用限制性内切酶SalI和SphI及T4DNA连接酶将RA连接到pUC18-LA-spc上，形成一个spcr基因两侧具有与ofs上下游同源序列同源的基因敲除载体pUC18-LSR(图1)，并通过双酶切和测序对其验证。

图1 ofs基因敲除载体构建示意图

1.2.2基因敲除突变株的构建和和鉴定 参照Smith等[12]的方法制备S．suis2 05ZYH33感受态细菌。在22.5 Kv/cm、500 Ω和25 μF电转参数下，将基因敲除载体pUC18-LSR电转化入感受态细菌，电转结束后将菌液涂布于THB平板(含100 mg/mL壮观霉素)，37 ℃培养48 h后，挑取单菌落进行培养并取2 μL菌液作模板，用引物对IN1/IN2 (位于ofs基因的内部)进行PCR初步筛选，并对疑似阳性菌株进行组合PCR和Southern杂交验证。

1.3生物学特性分析

1.3.1革兰氏染色分析 分别将突变株和野生型接种THB 培养基(含10%胎牛血清)中于37 ℃培养至OD600≈0.6, 用接种环取样均匀涂布于载玻片上, 自然晾干后进行常规革兰氏染色,于油镜( 1000 倍)下观察菌落形态。

1.3.2菌落形态和溶血活性的比较 将突变株△ofs和野生株 05ZYH33 用三线法分别划线接种于 THB琼脂血平板(5%绵羊血)， 37 ℃培养48 h后，观察突变株和野生株在菌落形态和溶血活性方面的差异。

1.3.3细菌生长速率的比较 取等量(OD600≈0. 008)的突变株和野生株菌液37 ℃振荡培养，每间隔1 h测取OD600值，直至细菌生长处于稳定期，重复实验3次并绘制生长曲线。

1.3.4小鼠致病性实验 参照本实验室常规的方法进行[13-15]。30只BALB/c小鼠随机分为3组，每组10只。将野生株05ZYH33和突变株Δofs于37 ℃过夜培养12 h，次日以1∶100的比例接种于新鲜配制THB中生长至OD600≈0.4，分别经腹腔接种野生株05ZYH33与敲除株Δofs菌液各1 mL (1×108CFU / 只)，阴性对照组注射THB培养基1 mL，及时观察记录小鼠发病及死亡情况。

2 结 果

2.105ZYH33ofs基因敲除载体的验证 对构建好的重组质粒进行PCR(图2)和双酶切验证(图3), 结果与预期一致。对重组质粒的测序结果也显示3个片段LA(1 024 bp)、Spc(1 130 bp)和RA(989 bp)连接测序正确，重组质粒构建成功。

2.205ZYH33ofs基因敲除突变株的初步筛选 用引物对IN1/IN2对挑取的单菌落进行PCR。由于引物对IN1/IN2位于ofs基因内部(产物大小为915 bp)，如果ofs基因被Spc抗性基因所置换，那么PCR扩增会得到阴性结果，反之则说明ofs基因未被敲掉。通过这种方法进行初步筛选。在一组菌液PCR扩增中，IN1/IN2引物扩增结果(图4)中3泳道为阴性，选择该株做进一步验证。

图2PCR扩增产物凝胶电泳

Fig.2GelelectrophoresisofPCRproduct

1: 1 kb DNA ladder marker; 2: PCR products with LA1/LA2; 3: PCR products with Spc1/Spc2; 4: PCR products with RA1/RA2; 5: PCR products with LA1/Spc2; 6: PCR products with Spc1/RA2; 7: PCR products with LA1/RA2.

图3pUC18-LSR双酶切鉴定

Fig.3RestrictionenzymedigestionoftherecombinantplasmidpUC18-LSR

1: 1 kb DNA ladder; 2: Digested byEcoR I andBamH I; 3: Digested byBamH I andSalI; 4: Digested bySalI andSphI; 5: Digested byEcoR I andSalI; 6: Digested byBamH I andSphI; 7: Digested byEcoR I andSphI.

图4PCR鉴定

Fig.4PCRanalysis

1: 1 kb DNA ladder marker; 2-9: Mutant strains; 10: Positive control (DNA of 05ZYH33);11: Negative control (sterile water).

2.305ZYH33ofs基因敲除突变株的组合PCR鉴定 根据05ZYH33 基因组DNA序列，分别于ofs编码基因上下游的外侧设计两条引物OUT1(位于LA上游)和OUT2(位于RA下游)，引物位置如图5A所示。ofs基因敲除突变株用引物对OUT1/Spc2、Spc1/OUT2和Spc1/2经PCR扩出大小分别为2 225 bp、2 246 bp和1 130 bp的片段，而在野生菌株05ZYH33中则未见相应片段，以野生株05ZYH33基因组为模版，用引物IN1/IN2能扩出的915 bp的片段，在突变株中未能扩出相应片段。组合PCR的结果(图5B)与以上理论完全一致。同时，用引物对OUT-1 /OUT-2 扩增的PCR 产物(图5C)进行克隆和测序，测序结果亦证明所获得的菌株已经成功发生双向同源重组。

图5组合PCR鉴定

Fig.5Multiple-PCRanalysis

A: Primers design;

B: IN1/IN2: 1--05ZYH33, 2--Δofs; Spc1/Spc2:

3--05ZYH33, 4--Δofs; OUT1/Spc2: 5--05ZYH33,

6--Δofs; Spc1/OUT2: 7--05ZYH33, 8--Δofs;

C: OUT-1 /OUT-2: 1--05ZYH33, 2--Δofs.

2.405ZYH33ofs基因敲除突变株的Southern鉴定 通过Southern杂交对Δofs基因组上的突变基因进行定位分析。使用ofs基因中间片段(引物IN1/IN2的PCR产物)作为标记探针，用随机引物法进行生物素标记，参照试剂盒说明书进行操作。杂交结果如图 6B所示，基因敲除载体pUC18-LSR 与细菌的染色体重组后可能出现3种情况(如图6A所示)，3种情况下杂交带的大小有所不同。在野生株05ZYH33基因组酶切产物中，出现了一条约4.5 kb的ScaI单酶切片段,与预计酶切片段4.5 kb(等位基因置换)大小相符(图6B，泳道1)，而在突变株中未出现条带(图6B，泳道2)，说明SpcR基因已经通过双交换同源重组置换了ofs编码基因(图6A-I)。在mutant1基因组酶切产物中，出现了一条大约7.2 kb的ofs探针杂交带，说明mutant1只是发生了5′端同源序列单交换的突变株(图 6B，泳道 3)。结果充分证实ofs基因在基因水平已被成功敲除。

Fig图6A同源重组示意图

FigFig.6AHomologousrecombinationschematicdiagram

Ⅰ: Double cross-over; Ⅱ: 5′ single cross-over; Ⅲ: 3′ single cross-over.

图6B突变株Δofs的Southern杂交分析

Fig.6BSouthernhybridizationanalysisofmutantΔofs

1: 05ZYH33 genome/ScaI; 2: Δofsgenome/ScaI; 3: Mutant1 genome/ScaI.

2.5革兰氏染色分析 取生长至OD600≈0.6的突变株△ofs和野毒株05ZYH33进行革兰染色，显微镜下观察发现(图7)，二者均为典型的革兰阳性菌，菌体形态为圆形或椭圆形，呈链状排列，呈短链状排列，无明显差异。

图7 革兰氏染色分析

2.6菌落形态和溶血活性的比较 将野生株05ZYH33和突变株△ofs接种于羊血THB 平板并于37℃孵育48 h 后，可见二者均长出灰白色、圆形半透明、湿润、表面光滑的细小菌落(直径为1～2 mm)，菌落周围有明显的β-溶血环 (图8)。表明与野生株相比，突变株的菌落形态和溶血活性没有发生明显的变化。

图8 溶血活性分析

2.7细菌生长特性比较 在相同的培养条件下绘制野生株与突变株的的生长曲线(图9),从图中可以看出，突变株和野生株的生长速率相近，于接种后3 h左右进入对数生长期，约在培养10 h后进入平台期，并无显著差别。

图9 生长特性比较

2.8小鼠致病性实验 观察结果显示，攻毒16 h后野生株注射组死亡9只，突变株死亡5只。24 h后野生株注射组小鼠全部死亡，突变株4只存活。36 h后突变株3只存活。阴性对照组10只状态均良好。持续观察3 d，未见发病和异常情况发生。用Kaplan-Meier生存函数分析方法比较突变株与野生组小鼠的存活率，并绘制生存曲线(图10)，P<0.05，说明ofs基因敲除使得05ZYH33的毒力减弱。

图10小鼠生存曲线

Fig.10SurvivalcurvesforBABL/cmiceinfectionexperiments

3 讨 论

猪链球菌血清浑浊因子OFS是新近鉴定的猪链球菌中的一种毒力因子。Baums等[10]研究表明OFS具有革兰氏阳性细菌表面蛋白的典型特征：N-末端的信号肽，大的N-末端区域，重复序列和C-末端的LPXTG锚定位点。本研究前期通过生物信息学分析发现，S.suis2 05ZYH33 中存在ofs编码基因[11]。通过比较OFS与S.pyogenes的SOF及S.dysgalactiae的FnBA的序列，发现OFS与SOF及FnBA在序列上有同源性，推测它们在功能上也有相似性。它们属于一类称作微生物表面识别粘附基质分子的组分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules，MSCRAMMs)的细菌表面配基。广泛存在于哺乳动物的组织液、基质或细胞的外表面，是化脓性链球菌、停乳链球菌黏附和定植到宿主细胞表面的主要介质，因此这些蛋白是链球菌入侵的重要毒力因子[16]。

在S.pyogenes中通过插入失活构建的sof突变株对小鼠的致病能力降低，在人全血中的存活率也降低[17]。用重组的SOF能够起到免疫保护作用，揭示SOF是一种重要的毒力因子[18]。以猪为模型的动物实验也证实ofs的缺失导致2型猪链球菌毒力的降低[10]。对于猪链球菌毒力因子的研究一直是热点，荚膜多糖CPS为S.suis2 中目前唯一明确的毒力因子。然而并不是所有有荚膜的2型猪链球菌菌株都有致病性。不同的菌株间毒力上存在着差异[19-20]。

实验室前期基于基因敲除技术，致力于探索研究新的致病相关基因的功能及其在S.suis与宿主相互作用中发挥的作用，构建了多个S.suis2毒力相关因子突变株，对它们的致病力强弱及致病机制进行了相关研究，为深入探讨猪链球菌2型致病机制积累了丰富的数据资料。本研究根据同源重组原理构建了中国强毒株05ZYH33ofs基因全长敲除突变株，并通过组合PCR、Southern杂交和DNA测序对敲除突变株进行了鉴定。通过一些生物学特性比较显示, Δofs基因突变株和野生株05ZYH33在成链形态及链长短、溶血活性、生长特性方面均无明显差异。小鼠毒力实验表明ofs基因缺失株的毒力较野生株明显降低，与前述报道的结果相似。由此可见，OFS是中国强毒株05ZYH33的一个潜在毒力因子。在此基础上我们还将进一步研究△ofs突变株与野生株在粘附和抗细胞吞噬方面的差异，以期阐明ofs基因在猪链球菌2型05ZYH33强致病过程中的作用机制。

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