猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

纪 燕，熊祺琰，韦艳娜，马庆红，白方方，冯志新，刘茂军，邵国青

猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是第一种从猪体内分离得到支原体[1]，可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,导致保育猪、育肥猪等生长性能下降，, 对养殖业造成巨大危害[2-4]。Mhr也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物[5]，同时近年来许多研究证实其与多种人类肿瘤的发生有明显的相关性[6-7]。目前，有关Mhr的研究较少，其与宿主之间的关系、发病机制、免疫逃避机制以及不同毒株的致病力差异等诸多问题尚未定论。Mhr对宿主细胞的黏附是其侵入机体的第一步也是关键的步骤[8-9]，因此对于Mhr黏附细胞机制的深入研究至关重要，可为疾病病因阐释及疫苗研发奠定基础。本研究建立的Mhr黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法为利用体外感染细胞模型研究Mhr黏附、侵染宿主细胞以及其黏附因子等的研究奠定基础。

1 材料及方法

1.1菌株、细胞及试剂 猪鼻支原体10071603株及猪肾上皮细胞PK15均由江苏省农业科学院兽医研究所家畜疾病防控研究室保存。

兔抗Mhr多抗由实验室自制，用Mhr全菌抗原免疫新西兰大白兔，共免疫三次，每次间隔2周，第三次免疫后2周采血，制备血清后，用饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体，PBS透析后分装于-20 ℃冻存，效价测定为1∶51 200；FITC-羊抗兔IgG，购自武汉博士德生物工程有限公司；DMEM,购自Gibco公司；小牛血清，购自兰州民海生物工程有限公司。

1.2Mhr培养 Mhr10071603株以1∶10比例接种于含20%猪血清的KM2培养基，待菌液生长至对数生长期时备用。

1.3PK15细胞培养 PK15细胞用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的DMEM培养液培养，待细胞汇合至90%以上时，胰蛋白酶消化。细胞以2×104个/孔接种于96孔细胞板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

1.4Mhr黏附细胞 取4 mL新鲜培养的处于对数生长期的Mhr,12 000 r/min离心30 min。菌体沉淀用PBS洗涤一次，DMEM维持液(含2%的小牛血清)重悬菌体备用。96孔板中的细胞用PBS洗涤一次。将DMEM维持液重悬的Mhr菌体按100 μL/孔接种于铺有细胞的细胞板中，于37 ℃黏附一定时间。用PBS洗涤未黏附的Mhr，洗涤3次，每次5 min。冰乙醇4 ℃固定30 min,100 μL/孔。

1.5间接免疫荧光试验程序 冰乙醇固定后的96孔板用PBS洗涤3次，每次5 min；用1% BSA 4 ℃封闭过夜；次日用PBS洗板3次，每次5 min；然后加入100 μL 1∶100稀释的兔抗Mhr多抗，于37 ℃孵育1.5 h；用PBS洗板4次，每次5 min；然后加入50 μL 1∶50稀释的荧光二抗FITC-羊抗兔IgG, 于37 ℃避光孵育1 h；然后用PBS洗板5次， 每次5 min。最后将细胞板置于倒置荧光显微镜下观察结果。

1.6间接免疫荧光试验最佳工作条件的确定 以下试验分别对黏附滴度、黏附时间、一抗工作浓度及二抗工作浓度4个指标进行优化，每次仅改动一个变量。

1.6.1Mhr 黏附滴度的确定 用颜色改变单位法(Colour chang unit,CCU)测定DMEM维持液重悬的Mhr的滴度。同时将DMEM维持液重悬的Mhr菌液按10倍系列稀释接种于铺有细胞的孔中，孵育6 h后,进行IFA试验，其它条件同上述反应程序。观察Mhr滴度对试验结果的影响。

1.6.2Mhr黏附时间的确定 Mhr黏附PK15细胞的时间分别采取1 h、2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，进行IFA试验，其它条件同上述反应程序。观察黏附时间对试验结果的影响，确定最适的Mhr黏附时间。

1.6.3一抗工作浓度的确定 将纯化的兔抗Mhr多抗(效价为1∶51 200)进行1∶10、1∶100、1∶500、1∶1 000倍稀释，进行IFA试验，其它条件同上述反应程序，观察比较不同稀释度对试验结果的影响，确定最佳的一抗工作浓度。

1.6.4二抗工作浓度的确定 以上述确定的最佳抗体稀释度作为一抗的工作浓度，分别将市售荧光二抗作1∶100、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400倍稀释，其它条件同上述反应程序，进行IFA试验，测定呈现明显荧光强度的最大稀释倍数，确定最适的二抗工作浓度。

2 结 果

2.1Mhr 黏附滴度的确定 试验结果表明，1×109CCU/mL、1×108CCU/mL的Mhr与PK15作用6 h，可见大量的Mhr黏附于细胞；1×107CCU/mL的Mhr与PK15作用6 h,有较多量的Mhr黏附于细胞；1×106CCU/mL与PK15作用6 h,仅少量的Mhr黏附于细胞、1×105CCU/mL的Mhr与PK15作用6 h,与阴性对照区别不明显。表明Mhr黏附PK15细胞的最小滴度为1×107CCU/mL(图1)。

2.2Mhr黏附时间的确定 试验结果表明，当Mhr与PK15作用1 h时，仅有少量Mhr黏附于细胞表面；当作用4 h时，黏附的Mhr明显增多，作用6 h和8 h时可看到大量的Mhr黏附于细胞表面。而当作用到达10 h时，细胞开始出现一定的脱落，这可能与Mhr对细胞的感染损伤有关。当间接免疫荧光试验用于研究Mhr对细胞黏附作用时，可选择作用6～8 h(图2)。

2.3一抗工作浓度的确定 试验结果表明，当一抗以1∶10、1∶100稀释时，特异性荧光强度高；当一抗以1∶500、1∶1 000稀释时，特异性荧光强度相当较弱，考虑试验的操作性和便利性，确定一抗的最佳工作浓度为1∶100(图3)。

图1不同滴度的Mhr与PK15的黏附作用

Fig.1AdherenceofMhrwithdifferenttiterstoPK15cells

Titers adhesion to PK15 cells are shown.

A: 1×109CCU/mL; B: 1×108CCU/mL; C: 1×107CCU/mL; D: 1×106CCU/mL; E: 1×105CCU/mL;

F: Negative control.

图2Mhr与PK15作用不同时间对黏附作用的影响

Fig.2AdherenceofMhrtoPK15cellsaffectedbyreactiontime

Results of Mhr adhesion to PK15 cells for 1 hour (A), 2 hours (B), 4 hours (C), 6 hours (D), 8 hours (E), and 10 hours (F) are shown. G: Negative control

2.4二抗工作浓度的确定 试验结果表明，当二抗以1∶100、1∶400、1∶800、1∶1 600稀释时，特异性荧光强度依次降低，但整体仍维持在较好水平；当二抗以1∶3 200、1∶6 400稀释时，特异性荧光强度相当较弱，因此二抗的最佳工作浓度确定为1∶1 600(图4)。

图3一抗工作浓度对荧光效果的影响

Fig.3Influenceofdifferentdilutionoffirstantibodytofluorescenteffect

Results of 1∶10 (A), 1∶100 (B), 1∶500 (C), and 1∶1 000 (D) dilution of first antibody to fluorescent effect are shown. E: Negative control.

图4二抗工作浓度对荧光效果的影响

Fig.4Influenceofdifferentdilutionofsecondantibodytofluorescenteffect

Results of 1∶100 (A), 1∶400 (B), 1∶800 (C), 1∶1 600 (D), 1∶3 200 (E), and 1∶6 400 (F) dilution of second antibody to fluorescent effect are shown. G: Negative control

3 讨 论

目前，关于Mhr黏附宿主细胞及感染致病机制的研究较少。William[10]等人在早期发现大多数Mhr菌株能够黏附到原代猪肾细胞质膜表面，通过聚集一定数量损害细胞质膜，引起细胞颗粒状、胞浆浓缩等细胞质损伤特征，但对细胞核未造成直接损害，该发现为Mhr感染细胞相关方面的研究提供思路。但目前对于Mhr的黏附因子尚未见报道。另一方面，Jonathan D[11]等人认为，Mhr仅黏附于细胞表面并不能造成细胞的发病，宿主细胞与入侵的Mhr之间互作信号的产生是造成细胞损伤的关键。

本研究建立的Mhr黏附PK15细胞的间接免疫荧光检测方法为Mhr感染细胞机制的体外研究提供了基础方法。用兔体制备的Mhr免疫血清纯化多抗为一抗，未观察到明显的由交叉反应导致的本底偏高的现象，说明直接用多抗进行Mhr黏附细胞的间接免疫荧光检测是可行的，避免了单抗制备以及单抗反应效果可能不佳的问题。经结果分析发现，当Mhr与PK15细胞作用达到10 h时，相较于孵育6、8 h的细胞数量发生了一定降低，镜检观察细胞状态变差，如果继续作用更长的时间，细胞会出现更明显的脱落情况。这很可能与Mhr逐步地对细胞进行体外感染、影响细胞生长状态有关。因此，如果单纯研究Mhr对细胞的黏附情况，或者对其黏附因子进行研究，将孵育时间控制在8 h以内，可以保持较好的细胞形态，而如果要研究Mhr对细胞的侵染、与细胞的相互作用等，可以考虑选择更加长的作用时间，能够较明显地观察细胞的变化。

参考文献：

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