葡萄酒酿酒酵母果糖利用影响因素的研究进展

赵文英 贾万利

（中北大学化工与环境学院，太原 030051）

葡萄酒酿酒酵母果糖利用影响因素的研究进展

赵文英 贾万利

（中北大学化工与环境学院，太原 030051）

葡萄酒酒精发酵后期，酿酒酵母果糖利用能力与酒精发酵中止和发酵不彻底密切相关，而且残余果糖还可能带来微生物污染和酒体失衡的危险。从酿酒酵母己糖跨膜转运、己糖胞内磷酸化及发酵条件（葡萄糖浓度、乙醇和温度）对果糖利用影响等方面的研究进展进行了综述，对筛选和构建高果糖利用优良葡萄酒酿酒酵母研究，以及生产中合理控制酒精发酵过程具有重要指导意义。

葡萄酒 酿酒酵母 果糖

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）常常被筛选作为葡萄酒酒精发酵菌种［1］。葡萄浆汁中葡萄糖和果糖含量基本相等，但在酒精发酵过程中，酿酒酵母利用葡萄糖的能力通常比利用果糖的能力强。其结果是果糖与葡萄糖比例随着发酵的进行不断升高，以致在发酵后期果糖成了主导糖。葡萄酒酵母必须在长期饥饿和大量乙醇存在的情况下发酵果糖。由于果糖摄取困难造成营养的不平衡，胁迫因素可能被放大，从而改变了酵母活性，导致酒精发酵中止［2，3］。而且酿酒酵母的低果糖利用能力也与发酵后期低发酵速率和发酵不彻底有关［4，5］。另外，由于果糖不能被有效利用而残留在葡萄酒中，一方面果糖甜度高，会造成葡萄酒口感失衡；另一方面，酒中残糖的存在具有引发微生物污染的危险［1，5］。因此，酿酒酵母的果糖利用能力影响因素的研究备受关注。

不同酿酒酵母菌果糖发酵能力不同，Liccioli等［6］对20株商业用酿酒酵母进行了果糖利用能力的测定。其中FERMICHAMP果糖利用能力最强，BORDEAUX RED最弱。赵文英等［7］通过数学方程拟合了不同菌体在模拟葡萄汁培养基条件下，发酵情况与单糖利用之间的关系，也表明不同酿酒酵母

的葡萄糖果糖利用能力不同。为寻找酿酒酵母利用葡萄糖和果糖的差异，需要考虑1，6-二磷酸果糖形成前的一些步骤，包括己糖的跨膜转运及胞内磷酸化，以及发酵过程中，不断变化的环境因素对果糖跨膜转运的影响。

1 己糖跨膜转运对酿酒酵母果糖利用的影响

己糖的吸收是个主动转运的过程。酿酒酵母中己糖的跨膜转运是糖代谢的关键步骤，其己糖转运载体组成强烈影响着菌体的发酵特性［8］。已鉴定出约20个基因编码相关的转运蛋白和感受体（HXT1 to HXT17、GAL2、SFN3 和 RGT2）参与己糖的转运［9］。

研究表明，Hxt1-7p是酿酒酵母中发挥主要作用的转运蛋白，对发酵条件下的葡萄糖和果糖的利用非常重要。这些转运蛋白在底物专一性和亲和力方面有差异。HXT1和HXT3编码的是低亲和力转运体，HXT6、HXT7编码的是高亲和力转运体，其他基因编码的是中等亲和力转运体［8］。转运体蛋白对单糖亲和力的高低会影响不同单糖的代谢速率，通常，这些转运蛋白对葡萄糖的亲和力大于对果糖的亲和力，这是造成葡萄糖发酵速率高的重要原因［9］。尽管Hxt3p对糖的亲和力低，但在发酵过程中对糖的转运发挥着尤为重要的作用［10］。Kapella等［11］发现缺乏HXT3的菌株在5%乙醇培养基中不能彻底发酵，这也说明Hxt3p在发酵过程中，在有乙醇存在的情况下，对糖的转运至关重要。

酿酒酵母FERMICHAMP通常能使葡萄酒发酵至干，具有较强的果糖利用能力［5，12］。通过分析该菌体HXT己糖转运体的基因发现，该酵母菌具有突变的HXT3等位基因。通过在hxt1-7Δ全缺陷菌体中表达该HXT3突变基因发现，该基因具有高果糖的利用能力。推测该基因对FERMICHAMP发酵过程中的葡萄糖/果糖比值变化起着重要作用［12］。

除HXT系 列 基 因 之 外，Galeote 等［13］在EC1118及其他一些葡萄酒酿酒酵母基因测序过程中鉴定出了FSY1基因，该基因与巴斯德酵母（Saccharomyces pastorianus）中的果糖转运体Fsy1p的基因序列具有同源性。利用hxt1-7Δ全缺陷的菌体来表达该基因后，结果表明，FSY1对果糖具有高亲和性，而且乙醇可诱导其表达。Lin等［15］在分析有氧发酵酵母和有氧酵母的转运蛋白基因组成时发现，己糖转运蛋白基因拷贝数与有氧发酵强度具有强烈正相关性，即转运蛋白基因拷贝数的增加有助于酿酒酵母向有氧发酵方向进化。通过菌种间水平基因转移获得的FSY1可增强EC1118的高果糖利用能力。

被转运至胞内的葡萄糖和果糖分子可通过己糖激酶进行磷酸化，然后进入糖酵解途径。己糖激酶Hxk1对果糖最大反应速率是葡萄糖的3倍，Hxk2对葡萄糖反应速率略微大于果糖。但随着底物浓度的降低，这两个磷酸化酶对葡萄糖和果糖的磷酸化速率也发生着变化［16］。Berthels等［17］认为葡萄糖果糖发酵能力的差异受己糖激酶活性影响，在实验室酵母体内过量表达己糖激酶Hxk1，可增强果糖的发酵速率。高果糖/葡萄糖磷酸化的速率和果糖磷酸化激酶对果糖的低Km可作为筛选高果糖利用菌株的参考。但也有很多学者认为细胞内糖的磷酸化能力超过了被转运至胞内的糖，因此己糖磷酸化不是造成发酵速率差异的根本原因［10，11，14］。这有待于进一步论证。

2 发酵条件对酿酒酵母果糖利用的影响

在葡萄酒发酵过程中，酵母处于高度变化的环境条件之中。己糖浓度从160-300 g/L降低至2 g/L，而乙醇浓度增加至15%。氮的耗竭使得细胞生长停滞，大多数糖被氮饥饿的细胞发酵所用。在整个酒精发酵过程中，酵母调整自身的己糖转运蛋白组成及磷酸化酶的活性以确保应对环境变化的最佳己糖转运和利用［14］。发酵环境因素包括葡萄糖浓度、乙醇、温度及氮源等，将对酿酒酵母转运蛋白及己糖激酶基因表达有重要影响。

2.1 葡萄糖浓度的影响

葡萄糖不仅是酿酒酵母的碳源，而且是酵母代谢和生长的整体调节因子［4］。有研究表明，高葡萄糖浓度可抑制酿酒酵母果糖的消耗量，低葡萄糖浓度可增强果糖的利用能力［18］。HXT基因的表达受环境因素的调节，特别是细胞外己糖浓度的影响，而葡萄糖是控制HXT基因表达的主要因素［6］。HXT2只在迟滞期短暂的表达，可能与启动生长的蛋白生成有关。低亲和力的转运体HXT1只局限在发酵前

期表达，尤其在细胞的生长阶段表达旺盛，但在稳定期不发挥作用。HXT5的表达取决于酿酒酵母的生长速率［19］。高亲和力的转运蛋白基因HXT6和HXT7在葡萄糖浓度低时被诱导，在葡萄糖浓度高时被抑制，即在发酵末期与糖的转运有关。而HXT3受葡萄糖浓度的调节很微弱，它也是唯一的在整个发酵过程中一直被表达的载体蛋白，在生长停滞期有最大量的表达，在稳定期缓慢降低，所以Hxt3p蛋白被认为是葡萄酒发酵过程中最稳定最重要的转运体［6，8］。在葡萄酒发酵后期，提高果糖的转运效率对预防发酵速率降低及发酵中止发挥着非常重要的作用。因此，不同酿酒酵母HXT3基因所表达的转运体是否存在差异，是否具有不同的果糖转运效率，有待进一步研究。

2.2 乙醇的影响

乙醇也是影响果糖利用的重要因素。乙醇能抑制糖的转运和利用，因为乙醇具有蛋白变性的特点，会扰乱质膜上己糖转运蛋白体的功能。另外，由于细胞膜通透性的增加，胞内酶的结构和活性也会受损［20］。Berthels 等［17］发现高浓度乙醇能抑制糖的利用，但对果糖的影响高于葡萄糖。这不仅能造成葡萄糖与果糖转运的差异，也可能是发酵过程中果糖难利用的原因之一。在此基础上，Zinnai等［21］在葡萄酒酒精发酵的模拟体系中，进一步分析了乙醇对葡萄糖和果糖利用的动力学特征。结果表明，在低乙醇浓度下，两者的代谢速率区别不大，两者具有相同的限速步骤。当乙醇浓度增加时，葡萄糖的代谢速率明显快于果糖的代谢速率，在此阶段，果糖代谢的限速步骤与葡萄糖的不同，这可能是果糖的转运体乙醇耐受性或果糖激酶活性大小有关。因此，在解决发酵中止问题时，不仅要考虑其接入的菌种乙醇耐受性，而且该菌种要求具有在乙醇胁迫条件下高果糖的转运利用能力［22］。

2.3 温度的影响

酒精发酵所采用的温度直接影响着酵母的生长和发酵持续的时间。在白葡萄酒和桃红葡萄酒的生产过程中，通常采用低温（10-15℃）以降低芳香物质的损失；在红葡萄酒的生产中，采用较高的温度（18-30℃）以充分提取单宁和色素［23］。但是，温度对葡萄糖和果糖利用差异的影响还不清楚。试验结果表明，无论在低温还是高温发酵条件下，酿酒酵母均表现出了嗜葡萄糖的特性。但在低温发酵时，有些菌体在刚开始发酵时具有嗜果糖特性［24］。

3 展望

综上所述，酿酒酵母果糖利用特性不仅与酵母本身的基因背景有关，而且还与发酵条件相关。尽管胞内己糖激酶活性对果糖利用差异的影响仍存在争议，但HXT3和FSY1己糖跨膜转运蛋白基因可能是葡萄酒酿酒酵母果糖利用的关键基因。这些关键基因有助于筛选和构建高果糖利用优良酿酒酵母。今后仍需进一步扩大葡萄酒酿酒酵母果糖利用的关键基因的认知，同时加强各种发酵条件对这些关键基因调控方面的研究，为解决酒精发酵中止和发酵不彻底的问题提供理论依据。

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（责任编辑 狄艳红）

Advance Research on Factors of Fructose Utilization in the Wine Yeast Saccharomyces cerevisiae

Zhao Wenying Jia Wanli
（School of Chemical and Environmental Engineering North Central University Shanxi，Taiyuan 030051）

Yeasts with a high fructose consumption capability are very important for winemakers to solve problems associated with sluggish or stuck fermentations. Residual fructose at end of fermentation also can cause undesirable sweetness and risk of microbiological spoilage in wines. The fructose consumption capability is dependent on the yeast’s genetic background and on external conditions. It was reviewed on the level of the transporters cross the cellular membrane, hexose phosphorylation, and the effects of external factors（glucose concentration, ethanol stress, temperature and nitrogen resources availability）. It is of significant importance in winemaking to find out and control the key factors that can have an effect on fructose utilization at end of fermentation.

Wine Saccharomyces cerevisiae Fructose

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.005

2014-05-08

山西省回国留学人员科研资助项目

赵文英，副教授，研究方向：葡萄酒微生物；E-mail：zzr1zwy2@163.com