卵母细胞裂解液逆转化体细胞为多能干细胞的研究进展

沈心怡 宋坤 杨利珊 肖雄 张大鹏 杨波 李跃民

（重庆市牧草与草食家畜重点实验室 西南大学动物科技学院，重庆 400715）

卵母细胞裂解液逆转化体细胞为多能干细胞的研究进展

沈心怡 宋坤 杨利珊 肖雄 张大鹏 杨波 李跃民

（重庆市牧草与草食家畜重点实验室 西南大学动物科技学院，重庆 400715）

采用卵母细胞裂解液重编程体细胞为多能干细胞是体细胞重编程的一个新思路，该方法主要是通过体细胞与卵母细胞裂解液的共孵育，使得体细胞在形态、基因和功能等方面发生改变，趋向于胚胎干细胞的方向发展。就卵母细胞裂解液重编程体细胞的研究现状、影响因素及存在的问题进行综述。

卵母细胞 卵母细胞裂解液 重编程 体细胞 多能干细胞

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）具有自我分裂增殖并且能够人工诱导分化成为机体内各种类型细胞的潜能，由于其独特的生物学特性，使得ESCs被广泛应用于生物学的众多研究领域。但是，为了避免毁损人类胚胎导致的伦理问题，近年来，对干细胞的研究热点转向了诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）领域，即通过体细胞重编程途径获得iPSCs。目前，用于体细胞重编程的方法主要有卵核移植、细胞融合、限定因子诱导和细胞抽提物诱导等。本文根据卵母细胞核移植的原理，对卵母细胞裂解液重编程体细胞的研究现状、相关机理以及现存问题进行综述。

1 卵母细胞裂解液重编程体细胞为多能干细胞的研究现状

细胞抽提物诱导法是将已分化的体细胞置于具有多潜能类型细胞（如卵母细胞、ESCs［1］、畸胎瘤细胞［2］）的抽提物中，通过其提供的能够诱发细胞核发生重编程的调控元件［2］，诱导体细胞发生重编程，最终获得iPSCs。Gurdon［3］采用体细胞核移植技术成功获得幼蛙；1997年，英国罗斯林研究所宣布利用成年母绵羊乳房上皮细胞为供核细胞进行核移植得到了体细胞克隆羊 “Dolly”［4］。2011年，吴苏君等［5］将牛成纤维细胞移植入生发泡期（Germinal vesicle stage，GV期）和MII期卵母细胞的细胞质以

后，经过培养其重组核移植卵的转录因子Nanog和Oct 4基因均被诱导表达，并且明显定位于所移植的成纤维细胞的细胞核上，而成纤维细胞组和未注射成纤维细胞的空白卵母细胞组中均未检测到Nanog和Oct 4的表达。试验表明移入体细胞核的卵母细胞具有诱导已分化体细胞发生重编程的能力，在卵母细胞质内的胞浆物质中含有特定的转录因子能够使移入的体细胞核表达Nanog和Oct 4类蛋白质活性物质。当采用液氮反复冻融的方法裂解卵母细胞并富集其有活性的胞浆物质后，细胞内参与重编程的一些关键蛋白和细胞因子、转录调控因子等能够被人为地富集起来，有利于对体细胞进行体外转化诱导，当与经链球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）通透化处理过的体细胞共孵育时，这些物质就有可能进入体细胞内发生作用，促使其发生内源性染色体结构重建、DNA甲基化、组蛋白乙酰化、印迹基因表达和维持多能性必需基因的活化等重编程过程，将已成熟分化的体细胞逆转化为多能干细胞的状态。与其他诱导法相比，卵母细胞裂解液诱导法还具有以下优势：（1）不存在被导入的ESCs（或多能性细胞）的染色体重编程；（2）利用卵母细胞裂解液可以将体细胞直接重编程、去分化为多能干细胞，而不用回归到胚胎状态，简化了重编程的方法，缩短了重编程的时间，同时，卵母细胞裂解液中多种成分的共同作用，为实现高效重编程奠定了基础；（3）通过操纵细胞提取物的成分有望识别与重编程有关的细胞因子，有利于阐明重编程的机制。

近年来，已有研究人员利用干细胞裂解液成功地将体细胞重编程为多能干细胞。McGann等［6］将C2C12起源的小鼠肌小管连续培养在蝾螈新生肢细胞提取物中发现，有18%的细胞发生去分化，成为可以进行DNA复制的成肌细胞，去除细胞提取物后，去分化细胞的表型依然存在，表明已经发生了细胞的重编程；2004年，Hansis等［7］报道爪蟾属卵母细胞提取物可以诱导293T细胞和白细胞发生重编程形成细胞团，这些细胞团外形上与ESCs形成的细胞克隆相似，可以表达Oct 4，而且碱性磷酸酶阳性；2005年，Taranger等［2］发现未分化的人类畸胎癌细胞——NCCTT可以重编程293T细胞成为具有多能性的未分化的细胞团。在NCCTT提取物中处理一周后，60%-70%的细胞显示出核内Oct 4蛋白标志；2010年，Han等［1］将人成纤维细胞培养在人类ESCs抽提物、5-氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine，5-Aza-dC）和曲古抑菌素（Trichostatin A，TSA）和维A酸的混合液中，形成了人类ESCs集落。

2 影响卵母细胞裂解液重编程体细胞效率的因素

2.1 卵母细胞的细胞周期

用于制备裂解液的卵母细胞所处减数分裂阶段的不同，体细胞重编程的效率存在差异。一般用作裂解液的卵母细胞为GV期和MII期卵母细胞。GV期卵母细胞中有线粒体ATP8基因的表达［8］。且GV期卵母细胞的核很大，染色质高度疏松，外包完整的核膜，此时的细胞核又称为GV［9］。哺乳动物卵母细胞MII期的维持与高水平的成熟促进因子（Mature promoting factor，MPF）活性有关，而MPF的活性则是由对Ca2+非常敏感的细胞静止因子（Cytostatic factor，CSF）所维持，MII期卵母细胞不断地合成CSF，使CSF一直处于高水平［10］，并且MII期卵母细胞中含有多种母源蛋白［11］。这两个不同时期的卵母细胞所含有的转录因子都可能对逆转化过程起到一定作用，但对移入细胞核的分裂形式表现不同。

Kwon等［12］采用GV期猪卵母细胞提取物（GVcyto）处理成纤维细胞，结果发现成纤维细胞的形态发生了变化，处理7 d形成小集落，培养3周后集落扩大，类似ESCs的集落形态，并且伴有Oct 4、Nanog蛋白的微弱表达和其他多能性标志物的变化，而未经GVcyto处理过的成纤维细胞没有显示任何形态变化或蛋白标志物的表达，表明GV期卵母细胞中存在重编程所需的必要的调控元件。Miyamoto等［13］分别用猪GV期和MⅡ卵母细胞抽提物评估诱导体细胞重编程的能力，前者诱导激活多能性标志基因的表达，细胞呈克隆样生长；后者重编程作用引起基因组H3K9去乙酰化、TATA盒结合蛋白（TATA box binding protein，TBP）消失，但没有明显的形态学变化，说明GV期和MⅡ期卵母细胞都具有诱导体细胞重编程的能力。因此，卵母细胞（GV期和MII期）裂解液中必定含有某些重编程作用因子，

可诱导体细胞的重编程。

2.2 体细胞的种类

由于成纤维细胞具有体内储量丰富、取材方便且易于分离培养等优势，保证了充足的实验材料，常被用于体细胞重编程的研究。除了成纤维细胞外，已有研究表明，在特定的转录因子诱导下，角质形成细胞比成纤维细胞更容易去分化为多能干细胞［14］，因为角质形成细胞中含有对上皮细胞具有比较强的促使分裂原活性的一种生长因子——角质细胞生长因子，其对组织损伤具有明显的促进修复和保护作用。在卵母细胞裂解液中角质形成细胞是否能替代甚至优于成纤维细胞还有待进一步研究。

2.3 卵母细胞裂解方法

细胞提取物的制备方法很关键，目前主要有以下4种：（1）液氮反复冻融法：将收集到的细胞经液氮反复冻融后，离心收集细胞裂解液的悬浮液作为细胞提取液，可保存在-80℃的超低温冰箱内［15］；（2）超声波处理法：采用直径2 mm的探针进行超声波脉冲破碎细胞，离心收集细胞裂解液，用液氮速冻后保存在-80℃的超低温冰箱内［16］；（3）高速离心法：使用固定角转头的高速离心机对细胞进行4℃、90 000 r/min离心破碎，细胞提取物转移到新的离心管后再离心一次，从而收取细胞提取液［13］；（4）玻璃吸管吹打法：采用口径在细胞和细胞核大小之间的显微吸管反复吹打细胞使其破碎，而细胞核没有破碎，此方法仅限于个体大的细胞，如卵母细胞和胚胎细胞［17］。

2.4 被诱导体细胞膜的通透性处理

SLO是胆固醇依赖性溶血素家族中的一员，是由溶血家族A链球菌分泌得到的单链聚合水溶性蛋白质。在适宜浓度下，SLO可以与细胞膜上的胆固醇聚合成由非共价键形成的弧形或环形的膜通道，而大部分细胞膜可保持完整。正是因为形成这样的膜通道，细胞提取物才得以进入到体细胞中。目前，比较成熟的方法是首先采用细菌毒素SLO穿透供体细胞的质膜，然后将供体细胞置于靶细胞的细胞提取物中共孵育，靶细胞特异性因子扩散入已被穿透的供体细胞，并被供体细胞的细胞核占据。细胞提取物进入到体细胞后，加入适宜浓度的CaCl2可以重新封闭膜通道，保持细胞膜的通透性。通过后续培养，分析细胞功能特征的改变，可以测定其重编程的效率。近年来，研究人员发现了可以替代SLO对细胞进行渗透化处理的物质——洋地黄皂苷（Digitonin）。洋地黄皂苷是一种非离子去污剂，可以与细胞膜胆固醇络合［18］。洋地黄皂苷只渗透化处理含高胆固醇的细胞膜部位，不会与细胞核膜发生反应，几乎不影响细胞骨架的完整性［19］。在2004年，Hansis等［20］研究发现，用洋地黄皂苷进行通透化处理的293T细胞与细胞提取物共培养后也可表达Oct 4基因；2012年，Yang等［21］研究发现15 μg/mL的洋地黄皂苷比10 μg/mL去甲基化的效果更好。

2.5 被诱导体细胞核内染色质结构的激活处理

研究发现，多能性相关的基因启动子DNA在体细胞中处于高度甲基化和低乙酰化状态，不具备发生转录的条件，而在干细胞中却是处于低甲基化和高乙酰化状态，有利于多能性相关基因的表达。2010年，Han等［1］研究发现，在人成纤维细胞与干细胞的细胞抽提物共培养之前，添加5-AzadC 和TSA处理成纤维细胞可以提高体细胞重编程的逆转化效率。5-Aza-dC是甲基转移酶抑制剂，在DNA复制过程中，可以与DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）结合形成一种共价复合物，抑制该酶的甲基转移活性，而达到去甲基化的目的。TSA是乙酰化酶抑制剂，其通过抑制去乙酰化酶的活性来提高组蛋白的乙酰化程度。TSA 可以广泛地改变表观遗传状态，激活基因表达，包括外源基因，不具有显著的特异性。

3 问题及应用前景

3.1 关于重编程的效率问题

卵母细胞裂解液的浓度和SLO的浓度的确定是影响体细胞重编程效率的关键因素，卵母细胞裂解液能够将成纤维细胞重编程为多能干细胞，但是没有确切的转化率报道。有文献报道细胞抽提物重编程的最高有效率为90%［22］，但是，由于在后期培养过程中不断地更换培养液，造成了重编程细胞的流失，以致无法获得准确的比例［23］。因此，需要进一步研究如何提高重编程效率和提出简单有效的计数方法。另外，对于卵母细胞裂解液重编程的作用机

理尚不明确，对裂解液中存在的有效成分也不了解，从而影响了重编程体系的稳定性。未来通过操纵细胞提取物的成分有望识别与重编程有关的细胞因子，有利于阐明重编程的机制，提高重编程的效率。

3.2 关于重编程所得多能干细胞的安全性问题

iPSCs是一种有望替代ESCs的一类细胞群，具有和ESCs类似的功能，而且绕开了人类ESCs研究一直面临的伦理和法律等方面的问题，基于以上两点，iPSCs成为了近年来干细胞研究的热点。但是，令人担忧的是，诱导所得多能干细胞存在着安全隐患。研究发现应用体细胞重编程的方法在体外诱导体细胞逆转化所得多能干细胞，具有较高的畸变率和癌变率。由于卵母细胞裂解液中所含有的重编程物质种类齐全、浓度高、含量丰富，在富集浓缩情况下对体细胞的重编程诱导作用应该表现得更加完全，所诱导出现的iPSCs更具有生理性，因此，采用卵母细胞裂解液重编程体细胞的方法，有望提高其安全性，成为今后研究的重点。

综上所述，采用卵母细胞裂解液重编程体细胞为多能干细胞的方法具有许多优势，如卵母细胞裂解液的制备过程较为简单、所得裂解液可以保存使用、重编程效率较高、所得iPSCs更具有生理性、可以有效避免毁损胚胎带来的伦理问题、用于卵母细胞来源动物或人时能够降低免疫排斥反应、改善克隆性治疗安全性。因此，卵母细胞裂解液介导体细胞重编程的方法在再生医学、药物筛选、疾病模型及其发育生物学等方面具有重要的研究意义和广阔的应用前景。

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（责任编辑 狄艳红）

Progress on Oocytes Extracts-mediated Derivation of Pluripotent Stem Cells from Somatic Cells

Shen Xinyi Song Kun Yang Lishan Xiao Xiong Zhang Dapeng Yang Bo Li Yuemin
（Chongqing Key Lab of Forage & Herbivore，College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400715）

Oocytes extracts-mediated derivation of pluripotent stem cells from somatic cells provides a new way for reprogramming. Morphologies, genes, and functions of somatic cells will be changed and somatic cells tend to be reprogrammed into stem cells after in-vitro coincubation with oocytes extracts. The present situation, influence factors, existing problems, and prospects of somatic cells reprogramming using oocytes extracts were described in this review.

Oocytes Oocytes extracts Reprogramming Somatic cells Pluripotent stem cells

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.004

2014-03-22

国家级大学生创新创业训练计划（201210635016）

沈心怡，女，硕士研究生，研究方向：临床兽医学；E-mail：564169219@qq.com

李跃民，男，教授，研究方向：动物胚胎工程； E-mail: lymswu@126.com