人源DCF1基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化

王倩 杨眉 冯瑞丽 王娇 文铁桥

（上海大学生命科学学院 分子神经生物学实验室，上海 200444）

人源DCF1基因原核表达载体构建及蛋白分离纯化

王倩 杨眉 冯瑞丽 王娇 文铁桥

（上海大学生命科学学院 分子神经生物学实验室，上海 200444）

为了深入研究DCF1（Dendritic Cell Factor 1）基因的作用，以质粒pcDNA3.1-DCF1-TAT为模板体外扩增得到片段DCF1-TAT，将测序正确的目的片段克隆入原核表达载体pET32a，转化大肠杆菌Rosetta（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并优化表达条件。以尿素溶解包涵体蛋白，并优化溶解条件，通过Ni离子亲和层析柱进行纯化，再透析复性目的蛋白。用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化结果，并用Western blot进行验证。结果表明，重组表达载体pET32a-DCF1-TAT构建成功，并在大肠杆菌Rosetta中成功表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在，经过尿素溶解，Ni离子亲和层析柱纯化获得高纯度的目的蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示蛋白分子量大小与预期结果相符。

人源DCF1基因 PTD TAT

DCF1是一种膜蛋白，早先发现它在神经干细胞的分化中起着重要的作用［1］。新近研究表明DCF1过量表达能有效地抑制恶性胶质瘤U251细胞系的增殖、迁移、侵袭能力并且促进细胞凋亡［2］。恶性胶质瘤是人类肿瘤中最具致命性的脑肿瘤，预后性最差，生存中期约为14个月［3］。颅内肿瘤好发人群主要在20-50岁之间，复发率高，给社会带来很大的压力。当前治疗胶质瘤的策略主要有外科手术、放射疗法、化学疗法、基因治疗。为了避免这些治疗方法的缺陷，重组蛋白药物已经被运用到临床试

验中。

蛋白质不能自由进入细胞，阻碍了蛋白药物的发展。对于脑胶质瘤，大分子蛋白治疗药物的运输常常被血脑屏障阻碍。然而，研究表明含有PTD（Protein transduction domain）的融合蛋白能够穿透细胞膜和血脑屏障［4，5］。PTD是具有蛋白转导功能的蛋白转导域，由特定的蛋白质功能域引领其所承载的蛋白质穿过膜性结构并在细胞内积累。自然界存在3种PTD，目前运用较多的是来自人类Ⅰ型免疫缺陷病毒的TAT蛋白转导结构域［8］。为此本研究构建了原核表达载体pET32a-DCF1-TAT，使用以大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系，在大肠杆菌Rosetta（DE3）中实现DCF1-TAT融合蛋白表达，旨在为深入研究DCF1蛋白功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

感受态大肠杆菌HB101，质粒pET32a和pcDNA3.1-DCF1-TAT由本实验室保存；大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株由吉永华教授实验室惠赠；限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ，T4 DNA连接酶，蛋白Marker等购自TaKaRa；异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sigma；Ni离子亲和层析柱购自Millipore；胶回收试剂盒购自生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 大肠杆菌表达载体pET32a-DCF1-TAT的构建 以质粒pcDNA3.1-DCF1-TAT为模板，利用PCR体外扩增DCF1-TAT片段，设计引物序列为：上游引 物：5'-AAAGGATCCATGGCGGCGCCGAAGGGG AGCC-3'；下游引物：5'-AAAAAGCTTTCTTCGTCGC TGTCTCCGCTTCTTCCTGCCATAAATTTCAGAATGA GC-3'（下划线分别为BamH I和Hind Ⅲ限制性内切酶序列）。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收目的片段。

将扩增的DCF1-TAT片段和pET32a空载用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ双酶切，胶回收目的片段并用T4 DNA连接酶于16℃过夜连接。把连接产物转化入大肠杆菌HB101感受态细胞，均匀涂于带Amp+抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱培养15 h。挑取单菌落接种到含100 mg/L Amp+的LB液体培养基（胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；氯化钠10 g/L）中，于37℃、230 r/min摇床中培养过夜。使用SDS碱裂解法小量制备质粒DNA，进行BamH I、Hind Ⅲ双酶切和测序鉴定。

1.2.2 诱导表达 将鉴定正确的重组质粒pET32a-DCF1-TAT热激转化到Rosetta感受态细胞中，再铺于带Amp+抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。次日挑取单菌落接种于2 mL含100 mg/L Amp+的LB液体培养基中，于37℃、230 r/min摇床中培养过夜。将培养好的菌液按照1∶50的比例接种到50 mL含100 mg/L Amp+的LB液体培养基中，37℃震荡培养2 h以上，至对数生长期OD600约为0.5时，停止培养。

1.2.2.1 诱导浓度的确定 待菌液OD600约等于0.5时，向溶液中加入IPTG溶液至其终浓度分别为0、0.1、0.6和1.0 mmol/L，放于37℃、230 r/min摇床培养4 h。4℃、8 000 r/min离心2 min，收集菌体，SDS-PAGE电泳（浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%）检测不同浓度诱导的融合蛋白表达情况，确定最适IPTG诱导浓度X。

1.2.2.2 诱导时间的确定 以最适诱导浓度X，温度37℃，转速230 r/min为固定条件，设置3个不同梯度的诱导时间4、6和8 h分别进行诱导，SDSPAGE电泳检测不同时间诱导的融合蛋白表达情况，确定最适IPTG诱导时间Y。

确定诱导条件为：温度37℃，转速230 r/min，IPTG浓度X，诱导时间Y。在此条件下大量培养转化菌株，于4℃、5 000×g离心15 min，收集菌体沉淀，保存于-20℃中备用。

1.2.2.3 融合蛋白的可溶性分析 用适量超声缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF）重悬菌体，300 W，超声5 s，停7 s冰浴超声破碎菌体。4℃、5 000×g离心15 min，分别收集菌体沉淀和上清溶液，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白在菌体沉淀和上清溶液中的溶解情况。

1.2.3 纯化包涵体蛋白

1.2.3.1 制备细胞抽提物 收集并称重菌体沉淀，按每克（湿重）菌体加3 mL细胞裂解缓冲液Ⅰ（50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH8.0）的比例重悬菌体，再加入4 μL 100 mmol/L

PMSF和80 μL 10 g/L溶菌酶，搅动20 min。每克（湿重）菌体加入4 mg脱氧胆酸，继续搅动。悬液37℃放置，不用磨光玻璃棒搅动，使其变黏时每克（湿重）菌体加入20 μL 1 mg/mL DNaseⅠ。裂解液室温放置，直至不再黏稠。

1.2.3.2 洗涤和变性溶解包涵体蛋白 将细胞裂解物于4℃、8 000×g离心15 min，弃去上清。菌体重悬于水中，4℃、8 000×g离心15 min。沉淀用包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素）重悬后，搅拌25 min，于4℃、8 000×g离心15 min，弃去上清，重复1次。再用适量的50 mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液洗涤1遍，于4℃、8 000×g离心15 min，弃去上清。设置尿素浓度梯度和溶解时间梯度确定最佳溶解包涵体条件：用含不同浓度尿素的包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，0.5 mol/L NaCl，4、6、8和10 mol/L尿素）重悬菌体，室温搅拌溶解1、2和5 h，4℃、8 000×g离心15 min，分别收集上清溶液。

1.2.3.3 包涵体蛋白纯化与复性 将Ni离子亲和层析柱用双蒸水洗两遍，加入200 μL填料，再用Binding buffer（300 mmol/L KCl，50 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L imidazole，1 mmol/L PMSF）洗两次。加入9 mL蛋白上清溶液，依次用20、40和60 mmol/L imidazole溶液洗1次，最后用250 mmol/L imidazole溶液洗脱。

将收集的洗脱流出液用稀释液（20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）按照1∶10的比例稀释并装入透析袋，用含适量甘油的0.01 mol/L PBS（pH8.0）透析48 h，每4-8 h更换1次PBS溶液，最后用双蒸水透析2次，每次6 h。再用超滤浓缩管浓缩透析后的溶液，-80℃保存。采用Western blot的方法对复性后的蛋白质进行检测分析。

2 结果

2.1 表达载体的构建

以质粒pcDNA3.1-DCF1-TAT为模板体外扩增的DNA片段分子量大小理论值为1 023 bp，图1-A结果显示1 kb附近的条带为所需的目的DNA片段。将扩增得到的DCF1-TAT片段与空载pET32a用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ双酶切，结果（图1-B）显示，胶回收酶切后的片段与线性载体，连接，进一步鉴定重组质粒是否连接正确。7个样品中有6个样品可以酶切出与目的片段大小相符的约1 kb的DNA片段（图1-C），挑取2号对应的菌液样品测序，测序结果表明已将DCF1-TAT片段成功克隆入pET32a载体中。

图1 构建表达载体pET32a-DCF1-TAT

2.2 优化诱导表达融合蛋白的条件

在大肠杆菌的最适生长温度（37℃）条件下，分别设置0、0.1、0.6和1.0 mmol/L IPTG浓度梯度。随着IPTG浓度的增加，在相同上样量的情况下，57 kD的蛋白条带逐渐变粗，且其中0-0.6 mmol/L IPTG诱导的蛋白质含量显著增加，而0.6-1.0 mmol/L诱导的蛋白质含量增加趋势缓慢（图2-A）。IPTG浓度过低不利于蛋白表达，过高则会影响菌体生长，选择最优诱导浓度为0.6 mmol/L进行诱导。

在4、6和8 h三个时间梯度诱导时发现，诱导6 h的57 kD融合蛋白表达量最多（图2-B），选择最优诱导时间为6 h。

超声破碎诱导后的菌体，发现目的蛋白几乎不溶于上清溶液，而是存在于破碎后的菌体沉淀中（图2-C）。该蛋白形成了包涵体，必须将包涵体蛋白变

性溶解于上清，才能进行后续的纯化蛋白操作。

图2 融合蛋白的诱导表达

2.3 包涵体蛋白的纯化与Western blot鉴定

经4、6、8和10 mol/L尿素溶解包涵体1 h后，上清溶液中均未出现蛋白条带，增加溶解时间至2 h后，包涵体蛋白开始溶解，8 mol/L和10 mol/L尿素溶解量相对较多且相近（图3-A），选择8 mol/L尿素进行溶解。将溶解时间增至5 h发现，近50%包涵体蛋白已经溶解于上清溶液中，且用250 mmol/L imidazole溶液纯化效率高，洗脱流出液中已经没有杂蛋白，全部为目的包涵体蛋白（图3-B）。Western blot对复性的包涵体目的蛋白检测显示（图3-C），57 kD的条带与预期蛋白分子量大小相符。

3 讨论

DCF1又称作跨膜蛋白59（TMEM59，Transmembrane protein 59），是一种与树突细胞的分化和迁移有关的信号分子［6，7］。DCF1编码的蛋白分子量大小为42 kD，该蛋白能够在大肠杆菌和神经干细胞中成功表达［8］。目前对于DCF1详细的功能还不是很清楚，但是据先前的研究表明，它可能与神经系统中，β淀粉样前体蛋白APP的糖基化和神经干细胞的分化调控有关［8，9］。此外，本实验室先前研究结果显示，过表达DCF1后，U251恶性胶质瘤细胞线粒体发生肿胀，嵴结构破坏并大部分消失，线粒体膜电位下降，细胞ATP含量减少。线粒体相关抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，促凋亡蛋白Bax表达上调，凋亡执行蛋白半胱天冬酶 Caspase-3 被活化［2］。

图3 纯化包涵体目的蛋白

为了进一步研究该蛋白对肿瘤细胞的功能，获得高纯度的目的蛋白十分重要。将克隆得到的DCF1-TAT片段连接入pET32a融合表达载体，成功构建载体pET32a-DCF1-TAT。为了获得大量的目的蛋白，对诱导剂IPTG的浓度和诱导时间两个表达条件进行优化。与对照组相比，经过IPTG诱导的融合

蛋白DCF1-TAT为特异性表达，并且蛋白表达量随IPTG浓度的增加而增加，其中IPTG浓度在0.1-0.6 mmol/L范围内增加显著，在0.6-1.0 mmol/L范围内增加缓慢。而蛋白表达量却不与诱导时间呈现正相关关系，在诱导6 h的时候出现最大值。所以确定的最优表达条件是0.6 mmol/L IPTG，诱导培养6 h。

在最优表达条件下培养转化菌可以提高融合蛋白的表达量，但是重组外源基因在大肠杆菌中高水平表达时，往往又会形成细胞内不溶性表达的无活性的包涵体固体颗粒。Georgiou等［10-12］发现天然的蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，如内酰氨酶和碱性磷酸酶的过量表达，都形成了包涵体，前者的包涵体在外周质，后者的包涵体存在于细胞质中。本试验中融合蛋白几乎不溶于上清溶液，主要以包涵体蛋白形式存在。选用强变性剂尿素溶解包涵体，通过设置尿素浓度梯度和溶解时间，发现包涵体蛋白随溶解时间的增加而逐渐溶解于上清溶液中，并且在8 mol/L尿素溶液中溶解量较多。但是由于尿素在碱性环境中长期保存后，容易分解成异氰酸盐导致多肽链自由基甲基化，溶解时间不宜过长，所以确定的最优溶解时间为5 h，尿素溶解浓度为8 mol/L。

pET32a载体带有6个His标签，是最常用的纯化蛋白的融合标签，具有相对分子质量小、不影响目的蛋白的功能，免疫原性相对较低、纯化操作简单、成本较低等优点［13，14］。溶解后的包涵体蛋白中还含有大部分的杂蛋白，为了减少杂蛋白对后续蛋白复性过程中的影响，优先进行蛋白纯化。试验发现，250 mmol/L imidazole溶液能够洗脱下高纯度的目的蛋白，但是大部分目的蛋白在低浓度imidazole溶液洗涤时便会随杂蛋白流出，可能是变性后多肽伸展完全致使亲和效率降低，所以我们多次回收流出液并重复纯化，得到大量的纯度较高的目的蛋白。

本试验成功克隆、诱导表达并纯化包涵体蛋白，摸索出一套改进的构建DCF1蛋白的原核表达体系，获取大量的包涵体目的蛋白。该蛋白可以用于下一阶段的细胞穿透试验，为进一步研究DCF1蛋白的功能提供了前提条件，也为治疗肿瘤提供新的思路。

4 结论

成功构建原核表达载体pET32a-DCF1-TAT。优化并得到融合蛋白DCF1-TAT的最佳诱导表达条件：0.6 mmol/L IPTG诱导6 h。该融合蛋白以包涵体形式存在，经过8 mol/L尿素溶液溶解、250 mmol/L imidazole溶液洗脱纯化，SDS-PAGE和Western bolt检测结果显示，获取了纯度较高的包涵体目的蛋白。

［1］Wen T, Gu P, Chen F. Discovery of two novel functional genes from differentiation of neural stem cells in the striatum of the fetal rat［J］. Neuroscience Letters, 2002, 329（1）：101-105.

［2］Xie Y, Li Q, Yang Q, et al. Overexpression of DCF1 inhibits glioma through destruction of mitochondria and activation of apoptosis pathway［J］. Scientific Reports, 2014, 4：3702.

［3］Van Meir EG, Hadjipanayis CG, Norden AD, et al. Exciting new advances in neuro-oncology：the avenue to a cure for malignant glioma［J］. CA：a Cancer Journal for Clinicians, 2010, 60（3）：166-193.

［4］Gou X, Wang Q, Yang Q, et al. TAT-NEP1-40 as a novel therapeutic candidate for axonal regeneration and functional recovery after stroke［J］. Journal of Drug Targeting, 2011, 19（2）：86-95.

［5］Deng B, Gou X, Chen H, et al. Targeted delivery of Neurogenin-2 protein in the treatment for cerebral ischemia-reperfusion injury［J］. Biomaterials, 2013, 34（34）：8786-8797.

［6］Wen T, Gu P, Chen F. Discovery of two novel functional genes from differentiation of neural stem cells in the striatum of the fetal rat［J］. Neuroscience Letters, 2002, 329（1）：101-105.

［7］Dietz AB, Bulur PA, Knutson GJ, et al. Maturation of human monocyte-derived dendritic cells studied by microarray hybridization［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, 275（3）：731-738.

［8］Wang L, Wang J, Wu Y, et al. A novel function of dcf1 during the differentiation of neural stem cells in vitro［J］. Cellular and Molecular Neurobiology, 2008, 28（6）：887-894.

［9］Ullrich S, Münch A, Neumann S, et al. The novel membrane protein TMEM59 modulates complex glycosylation, cell surface expression, and secretion of the amyloid precursor protein［J］. Journal of Biological Chemistry, 2010, 285（27）：20664-20674.

［10］Bowden GA, Paredes AM, Georgiou G. Structure and morphology

of protein inclusion bodies in Escherichia coli［J］. Nature Biotechnology, 1991, 9（8）：725-730.

［11］Valax P, Georgiou G. Molecular characterization of β-Lactamase inclusion bodies produced in Escherichia coli. 1. composition［J］. Biotechnology Progress, 1993, 9（5）：539-547.

［12］Georgiou G, Telford JN, Shuler ML, et al. Localization of inclusion bodies in Escherichia coli overproducing beta-lactamase or alkaline phosphatase［J］. Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52（5）：1157-1161.

［13］Graslund S, Nordlund P, Weigelt J, et al. Protein production and purification［J］. Nature Methods, 2008, 5（2）：135-146.

［14］Uchinomiya S, Nonaka H, Wakayama S, et al. In-cell covalent labeling of reactive His-tag fused proteins［J］. Chemical Communications, 2013, 49：5022-5024.

（责任编辑 李楠）

《农业展望》征订启事

《农业展望》是经国家新闻出版总署批准，由中华人民共和国农业部主管、农业部市场与经济信息司指导、中国农业科学院农业信息研究所主办的综合性农业科技类刊物。2005年8月创刊，面向国内外公开发行，设有 “主编速递”“产品预测”“农业经济展望”“农业生产展望”“农业科技展望”“农业贸易展望”“农业消费展望”和“数据信息”八大主要栏目。

本刊着重于对主要农产品生产、供需、价格、进出口的分品种分析与预测，密切关注当前农业经济发展进程中一些重大的关键性或热点、焦点问题，重点报道对农业经济形势、农业科技与农业、农产品贸易的分析和展望，既强调对农业经济领域的短期分析，也侧重于对农业政策、产业发展、农业贸易、农产品供需和粮食安全等的长期展望，并且每期都以一定篇幅刊载国内外主要农产品数据信息。

《农业展望》是政府机关、研究机构、农业企业、金融单位、期货市场、进出口商等开展经济分析、市场预测、投资判断、生产决策的可靠参考资料。

本刊为月刊，每册定价15.00元，全年定价180.00元。中国标准连续出版物号：CN11-5343/S；国际标准刊号：ISSN 1673-3908。广告许可证：京海工商广字第0095号。全国各地邮局均可订阅，邮发代号：80-283。

地 址：北京市海淀区中关村南大街12号《农业展望》编辑部

邮 编：100081

电 话：（010）82109913

E-mail：nyzw@caas.cn

Construction of a Humanized DCF1 Gene Prokaryotic Expression Vector and Protein Purification

Wang Qian Yang Mei Feng Ruili Wang Jiao Wen Tieqiao
（Laboratory of Molecular Neural Biology，School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444）

In order to further study the role of human DCF1 gene, the target fragment DCF1-TAT was amplified from plasmid pcDNA3.1-DCF1-TAT by PCR, and then cloned into a prokaryotic expression vector pET32a to construct the recombinant plasmid pET32a-DCF1-TAT, which was then transformed into Escherichia coli Rosetta（DE3）cells to express the fusion protein and induced to express by isopropyl-β-D-thiogalactoside（IPTG）, and meanwhile the expression condition was optimized. The inclusion body was dissolved by urea after the optimization of dissolution condition, purified by Ni ion affinity chromatography, and renatured by dialysis. SDS-polyaerylamide gel electrophoresis（SDSPAGE）and Western blot analysis were used to detect the fusion protein. The results indicated that the recombinant expression vector pET32a-DCF1-TAT was constructed and expressed in Rosetta successfully. The fusion protein existed in the form of inclusion body, and the target protein was obtained with high purity through the dissolution of urea and purification of affinity chromatography. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of fusion protein was in the expected line.

Humanized DCF1 gene PTD TAT

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.033

2014-05-16

国家自然科学基金项目（81271253）

王倩，女，研究方向：分子神经生物学；E-mail：happywangni@163.com

文铁桥，男，教授，博士生导师，研究方向：神经干细胞分化调控机制及信号传导途径、神经退行性疾病等；E-mail：tqwen@staff.shu.edu.cn